[目的]1種類のムチンが複数種の細胞株で発現する場合、また1種類の細胞が2種類以上のムチンを発現する際にそれらのグリコシレーションの異同について検討する。

　[方法]細胞株はヒト大腸癌細胞株HT29、ヒト喉頭癌細胞株H.Ep.2、ヒト膵癌細胞株Capan1を用いた。細胞の可溶化物をSDS電気泳動し、ゲルに対し直接ビオチン標識したレクチンまたはモノクローナル抗体(mAb)次いで¹²⁵I標識ストレプトアビジンを反応させ、結合するムチンおよび糖鎖をもつ糖蛋白質を検出した。また、細胞可溶化物をビオチン標識レクチンに次いでストレプトアビジンアガロースと反応させ、その上清および沈降物をSDS電気泳動し、抗MUC1抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。

　[結果と考察]今回用いた3種の細胞株の産生するMUC1ムチンはいずれもレクチン結合のパターンが異なっており、MUC1ムチンが提示する糖鎖構造は発現する細胞により異なることが判明した。これはそれぞれの細胞のもつ糖転移酵素に依存すると考えられる。

　次にひとつの細胞が複数種のムチンを発現している場合について検討した。HT29細胞はMUC1ムチンおよびMUC2ムチンを産生しているが、抗体の結合性から分子量450kDaおよび740kDaの成分はMUC1ムチンと考えられ、分子量>900kDaの成分はMUC2を含むムチンと考えられた。MUC1ムチンにはWGA(シアル酸のクラスターに結合)およびMAL(NeuNAc2-3Gal1-4GlcNAcに結合)が結合したがMUC2ムチンには結合しなかった。一方MUC2ムチンにはACA(NeuAc2-3Gal1-3GalNAcSer/ThrおよびGal1-3GalNAc Ser/Thrに結合)およびmAb TKH2(NeuAc2-3GalNAcSer/Thrに結合)が結合したがMUC1ムチンには結合せずMUC1ムチンとMUC2ムチンとで提示する主要な糖鎖構造が異なっていた(Table 1)。このようにひとつの細胞が複数のムチンを発現した場合それらの間で主要な糖鎖構造が異なるという現象が明らかになった。しかし細胞はクローンとなっておらず異なる細胞集団によりそれぞれのムチンが産生されているため糖鎖構造が異なるという可能性が残った。そこでMUC1遺伝子導入株を作成し、クローニングの後ムチン上の糖鎖について調べることにした。

TABLE 1:CARBOHYDRATE ANTIGENS DETECTED ON MUCINS FROM HT29 CELLS

　[目的]ヒト白血病細胞にMUC1ムチン遺伝子を導入した際のグリコシレーションにどのような特徴があるか、また内在性のムチン糖蛋白の糖鎖との異同について検討する。

　[方法]発現ベクターpDKOFにMUC1遺伝子全長を組み込むことにより作成したプラスミドpDKOF.muc1をエレクトロポレーション法を用いてK562細胞に導入した。400g/mlのgeneticinによりセレクションを行い、限界希釈法によりクローン化を行った。クローン化した細胞表面にMUC1ムチンやムチン関連糖鎖抗原が発現しているかどうか確かめるため、当研究室で樹立したシアル酸を含む成熟型糖鎖をもつMUC1ムチンを認識するmAb MY.1E12あるいはMUC1ムチンコアペプチドを認識するmAbHMFG2を用いたフローサイトメトリー法(FCM)およびwestern blot法による解析を行った。[³H]グルコサミンを30分取り込ませた後一定時間培養した細胞の可溶化物をMY.1E12あるいは抗CD43 mAb DFT1で免疫沈降しSDS電気泳動後オートラジオグラフィーを行った。

　[結果と考察]geneticin耐性細胞より、細胞表面にMUC1ムチンを安定に強く発現する細胞クローン2B4を得た。western blot法により発現したMUC1ムチンは分子量約300kDaであることが確認された。MY.1E12抗体が反応することから、発現したMUC1ムチンはシアル化された糖鎖も含むことが考えられた。FCMによる解析により2B4細胞表面にシアル酸をもたないT抗原(Gal1-3GalNAcSer/Thr;PNAで検出)の顕著な発現上昇が認められ、MUC1ムチン上に高い発現があることが示唆された(Fig 1)。Tn抗原(GalNAcSer/Thr;VVAB4で検出)、Sialyl-Tn抗原(NeuAc2-6GalNAcSer/Thr;mAb TKH2で検出)の発現の上昇は見られたが、Sialyl Lewis x抗原(mAb KM93で検出)の発現は見られなかった。

　K562細胞が発現している白血球ムチン糖蛋白質としてLeukosialin(CD43)が知られているが、FCMによる解析から発現したMUC1ムチンとCD43との間でT抗原の発現状況が異なることが考えられたため、これを確認した。2B4の膜画分のMY.1E12およびDFT1による免疫沈降物をSDS電気泳動後PVDF膜にブロットしPNAによる染色を行った。その結果MUC1ムチンはT抗原陽性であったが、CD43はT抗原陰性であった。この違いはCD43ではT抗原がシアル酸でマスクされているためであると予想された。そこでブロット後のPVDF膜を10%酢酸中80℃1時間処理しシアル酸を除去した後、同様にPNAで染色した。脱シアル酸処理した結果、CD4もT抗原陽性となったため2B4で発現しているMUC1ムチンではシアル酸が付加される程度が低いことが考えられた(Fig 2)。このシアル酸の付加の程度の違いにそれぞれのムチンの発現速度が影響するのではないかと考え[³H]グルコサミン標識によるパルスチェイス実験を行った。その結果MUC1は標識から9-11時間後、CD43は標識から11時間以降に標識グルコサミン取り込みのピークをもつことが判明したことから、MUC1ムチンとCD43のプロセシングの速度の差がシアル酸付加の度合いに反映しているのではないかと考えられた。

図表FIG 1:EXPRESSION OF CARBOHYDRATE EPITOPES ON 2B4 CELLSAS DETERMINED BY FLOWCYTOMETRIC ANALYSIS / FIG 2:PNA BINDING TO ELECTROPHO RETICALLY SEPARATED IMMUNOPRECIPITATES OF 2B4 CELL LYSATES

　[目的]2B4細胞のMUC1ムチン発現による細胞特性の変化のひとつとしてNK活性に対する感受性について調べた。

　[方法]ヒト末梢血よりFicoll-paqueを用いた遠心分離により白血球を得、ナイロンウールカラム非吸着画分をeffector細胞としNK活性を測定した。⁵¹Crで標識したtarget細胞とeffector細胞とをさまざまな比率で混合し、37℃で4時間反応させた。反応後の培養上清を回収し放射活性を-カウンターで測定した。細胞障害性は以下の式により算出した。細胞障害性(%)＝(サンプル放射活性-自然放射活性)×100/(最大放射活性-自然放射活性)

　[結果と考察]MUC1ムチン発現クローン2B4の細胞障害性は親株であるK562細胞および対照株に比べ有意に低下していた(Fig 3)。2B4細胞をシアリダーゼ処理して糖鎖末端のシアル酸を除去あるいはBenzyl-GalNAc処理しO-結合型糖鎖の伸長を阻害した後NK細胞に対する感受性を測定したところNK感受性のパターンに大きな変化はみられなかった。MUC1ムチン全体の構造がNK細胞との相互作用に影響を与えるためと推定される。

Fig 3

　[まとめ]MUC1ムチンと他のムチンとを同一の細胞が産生している際にそれぞれの糖鎖構造が異なることが確認された。差異が生じる原因は糖転移酵素の違いだけでなく種類の異なるムチンの細胞内でのプロセッシングの速度の違いである可能性が示唆された。MUC1ムチンはsialyl-Tn抗原、Tn抗原、T抗原など腫瘍関連抗原を提示しうることが確認された。MUC1ムチンの遺伝子導入による強制発現がNK細胞に対する抵抗性を産み出すことが示され、生体の癌細胞の排除の阻害に関与している可能性が示唆された。