MGMT mRNAの発現をノーザンブロット法により、HTLV-1非感染T細胞株(Jurkat、CEM、HSB-2)、HTLV-1感染T細胞株(MT-1、MT-2、HUT102、Hayai、MT-4)、ヒト骨肉腫由来HOS細胞、およびHOS細胞にHTLV-1が感染したHOS/MT-2細胞で調べた。HTLV-1非感染T細胞株ではMGMTの高発現が認められたが、HTLV-1感染T細胞株では、Hayaiを除いて発現が検出されなかった。また、HayaiについてもHTLV-1非感染T細胞株に比べて発現は減少していた。一方、HOS細胞のMGMTの発現は低いレベルで認められたが、HOS/MT-2細胞ではMGMTの発現は検出されなかった。以上の結果から、HTLV-1感染とMGMT遺伝子発現低下との間に高い相関性があることが示された(Table.1)。

　MGMT遺伝子発現低下のメカニズムとしてMGMTゲノムDNAの構造異常による不活性化、MGMTプロモーター活性の低下、MGMT mRNAの不安定化、の3つの可能性を検討した。

2-1)MGMTゲノムDNAの構造異常による不活性化

　細胞株から取ったゲノムDNAを、様々な制限酵素で消化し、MGMTcDNA、またはMGMT遺伝子の上流約4KbのDNA断片をプローブにしてサザンブロット法により解析した。その結果、発現のある細胞とない細胞との間でパターンの差は認められなかった。このことから、MGMT遺伝子発現のない細胞において、MGMTゲノムDNAに大きな構造異常はないことが示された(Table.1)。

Table.1

　MGMT遺伝子の発現低下を生じるHTLV-1遺伝子を同定する目的で、HTLV-1遺伝子のstable transformantを作成し、解析した。HTLV-1調節遺伝子であるTax、またはRexの発現プラスミドとネオマイシン耐性遺伝子の発現プラスミド(Neo)をHOS細胞に共導入した後に、ネオマイシンでコロニーを選択し、ウエスタンブロット法により、MGMTの発現を調べた。その結果、NeoだけのもしくはRexのstable transformantはすべて親株HOS細胞と同程度MGMTの発現が認められた。ところが、Taxのstable transformantは半分のクローンで発現の低下が見られた。そこで、発現低下が見られたstable transformantをサブクローニングし、MGMTの発現を検討した結果、サブクローンの約半分がMGMTを全く発現していなかった(Fig.1)。また、MGMT発現低下のメカニズムとしてMGMTゲノムDNAの構造異常による不活性化、MGMTプロモーターを介する転写抑制、MGMT mRNAの不安定性を検討したが、HTLV-1感染細胞株と同様な結果が確認された。以上の結果から、少なくともHTLV-1遺伝子産物TaxによってMGMT遺伝子発現の抑制が引き起こされることが示された。しかし、Taxの発現下でもMGMTの発現が存続するクローンもあり、かなりユニークなメカニズムを推定した。

Fig.1

　MGMTの発現とDNAのメチル化との関係が報告されている。そこで、DNAのメチル化の可能性を検討する目的で、細胞株、およびstable transformantから取ったゲノムDNAを、メチル化による影響を受ける制限酵素HapII、または受けないMspIで消化し、MGMT cDNAをプローブにしてサザンブロット法を試みた。その結果、MGMT遺伝子は、MGMT高発現の細胞(HTLV-1非感染T細胞株、Hayai)では高メチル化、MGMT低発現の細胞(HOS、stable transformant)では中程度のメチル化、そしてMGMTの発現が検出されない細胞(HTLV-1感染T細胞株、HOS/MT-2、stable transformant)では低メチル化状態にあることが明らかとなった。つまり、MGMTの発現とMGMT遺伝子のメチル化状態との間に高い相関性が認められた。そこで、MGMT遺伝子の低メチル化がMGMT遺伝子発現抑制の原因になりうるかどうかを調べる目的で、HOS細胞をDNAメチルトランスフェラーゼの阻害剤である5-aza-C(5-azacytidine)で48hr処理し、MGMT遺伝子発現をノーザンブロット法により検討した。その結果、MGMT mRNA量は5-aza-C処理により1/5に減少した。以上の結果から、MGMT遺伝子の低メチル化がMGMT遺伝子発現抑制の原因になりうることが示された。

　本研究において私は、ほとんど全てのHTLV-1感染細胞においてMGMT遺伝子発現が検出されないこと、HTLV-1遺伝子産物TaxによってMGMT遺伝子発現が検出されない細胞が出現してくること、MGMT遺伝子発現とMGMT遺伝子のメチル化状態との間に相関性があり、MGMT遺伝子の低メチル化がMGMT遺伝子発現抑制の原因になりうることを明らかにした。

　MGMTは組織特異的な発現を示すが、造血系、なかでもT細胞で発現が高い。また、健常人の末梢血リンパ球で実際、O⁶-メチルグアニンの存在が確認されている。さらに、アルキル化剤処理で生じる姉妹染色分体交換や染色体異常をMGMTは防ぐことができる。これらのことから、MGMTはT細胞においてゲノムの安定性に大きく寄与していると予想される。そういう意味で、今後ATL患者の白血病細胞を用いた解析によってMGMT遺伝子発現抑制とATL発症との関係を明らかにしていく必要がある。また、MGMT遺伝子発現抑制の原因としてMGMT遺伝子の低メチル化を示したが、メチル化の変化がこの発現抑制のprimary eventなのかどうかについても検討すべきと考えている。