3インテグリン遺伝子プロモーター領域の解析

　EMBL3で作製したマウスゲノムDNAライブラリー(1×10⁶pfu)を、3インテグリン全長cDNAをプローブにしてスクリーニングした結果、5つの陽性クローン(1、3a、3b、5、6)を得た。制限酵素解析およびサザンブロッティング解析の結果、2つのクローン(3a、3b)が3インテグリンのN末端領域をコードしていた。pBluescriptSKプラスミドにサブクローニングして塩基配列を解析した結果、クローン3aは約4kbの5’フランキング領域と、第1エクソンと、第1イントロンの一部を含んでいた。プライマー伸長分析の結果、主たる転写開始部位は翻訳開始のATGから328bp上流に位置し、そのすぐ上流にはTATAボックス様の配列が存在した。5’フランキング領域4kbをCATリポータープラスミドpGCATに挿入しプロモーター活性を検討した結果、HT1080線維芽肉腫細胞およびMRK-nu-1乳癌細胞においてプロモーター活性が認められた。この5’上流部分をさらに断片化して、CATアッセイによりプロモーター活性を検討した結果、最下流0.5kbの断片が最も強いプロモーター活性を示した(図1)。これよりも上流部分には、負の制御因子が存在すると考えられる。この0.5kb断片の塩基配列を解析した結果、この領域にはCAATボックスやGCアイランドのみならず、GATAモチーフや癌原遺伝子Etsや、Myo-D、およびc-Mycの結合配列も存在した(図2)。4インテグリンにはTATAボックスとCAATボックスが存在するが、2、5、IIb、L、Mインテグリンにはこれらは存在しない。3インテグリン遺伝子のプロモーター領域にはTATAボックス、CAATボックス、GCボックスが存在しており、これらが有効な転写開始複合体を形成しているのであろう。GATAモチーフは血小板においてIIbインテグリン遺伝子のプロモーター活性を調節すると報告されている。また、Ets蛋白質は4インテグリンのプロモーター活性を調節すると報告されている。IIbと2ではGATAモチーフとEts結合部位が近接して存在するが、3では離れて存在した。3遺伝子の発現調節におけるGATAモチーフとEts結合部位の役割については、今後明らかにしなければならない。近年、3インテグリンが一過性に筋原線維の形成に関与すると報告された。これは、3インテグリン遺伝子上のMyoD結合部位の存在と関連あるものと推察する。

Fig.1 Deletion Analysis of the Mouse 3 Integrin Promoter

Fig.2 exon 1 of the mouse 3 integrin gene

　制限酵素解析およびサザンブロッティング解析の結果に基づいて、5つのゲノムクローンを配置した(図3)。これらのクローンには3インテグリン全cDNAの約87%をカバーするエクソンが存在したが、cDNA518bpに相当するゲノムクローンは得られなかった。サブユニットのゲノムDNAは30kb以上の大きさからなり、20以上のエクソンで構成されていた。すべてのイントロンーエクソン結合部位は、mRNAスプライシングの規則配列を保持していた。第1エクソンには、5’非翻訳領域とシグナルペプチドと成熟ポリペプチドのN末端37アミノ酸がコードされていた。これは、4および5インテグリンと類似しているが、2インテグリンよりも大きな構造であった。3カ所存在する推定上の2価陽イオン結合ドメインは、複数のエクソンにまたがって存在していた。膜貫通ドメインも2つのエクソンにまたがって(22アミノ酸残基と4残基)存在していた。このスプライシング様式は、MおよびXインテグリンと類似していたが、Drosophila-PS2インテグリンとはまったく異なるものであった。他のインテグリン分子と比較して3インテグリン分子には、翻訳後切断部位が存在することと、いわゆるIドメインが存在しないことに特徴が見られる。これに相応して、3インテグリン遺伝子には切断部位をコードするエクソンが存在し、Iドメインのエクソンが欠如していた。3インテグリンには細胞内ドメインの異なる2つのバリアント(3A、3B)が存在し、これらはマウスにおいて臓器特異的発現が見られることが知られている。この2種の3インテグリンはmRNAスプライシングの違いで生ずるのではないかと推測されていたが、今回ゲノムDNAを解析した結果はこれを証明するものであった。

Structure of mouse 3 integrin gene

　以上、マウス3インテグリン遺伝子をクローニングして、プロモーター領域とエクソンーイントロン構造を解析した。一部分クローニング出来なかったところがあるものの、この研究は3インテグリン遺伝子の発現調節と、インテグリンファミリーに属す分子の進化を理解する上で、有意義なものと考える。