コラゲナーゼ潅流法により調製した分離直後のラット肝実質細胞におけるS1Pの細胞内Ca²⁺濃度に対する効果を調べた。S1Pによって細胞内Ca²⁺濃度は徐々に上昇し、約1分後にピークに達した。その後も上昇したCa²⁺濃度は少なくとも5分間は維持していた。一方、LPA投与下では細胞内Ca²⁺濃度は急速に上昇後、下降し、その後はピーク値の約50%値を維持するパターンを示した(図1a)。

図1 S1PおよびLPAによる細胞内カルシウム濃度上昇作用と初代培養の効果

図2 S1Pによるホスホリラーゼ活性化、PLC活性化およびcAMP産生の培養による効果(○;分離直後、●;培養後、■;培養後PTX処理)

　ラット肝実質細胞を初代培養するとアドレナリン受容体アゴニスト、バソプレッシンなどのCa²⁺動員アゴニストによる細胞応答が減弱することが知られている。そこで24時間初代培養後の肝細胞におけるS1P、LPA応答を調べた。予想どおりLPAによるCa²⁺応答は減弱していたが、意外にも、S1Pによる応答は初代培養の前に比べてむしろ大きくなった(図1b)。ピーク値を比べてみると、LPAのCa²⁺応答が約半分くらい減少したのに対してS1PのCa²⁺応答は初代培養後約3倍にも増加していた(図1c)。

　肝細胞において細胞内Ca²⁺はホスホリラーゼ(グリコーゲン分解の律速酵素)活性の重要な制御因子の1つである。分離直後の肝細胞でホスホリラーゼ活性を測定したところS1PとLPAは濃度依存的に酵素を活性化した(図2のaとb、白丸)。S1PとLPAによるホスホリラーゼ活性化の時間経過はCa²⁺応答のパターンに類似していた。すなわち、LPAの一過性の上昇パターンに対し、S1Pによって酵素活性は比較的ゆっくりと上昇し、その値は持続的であった。24時間初代培養後の肝細胞ではCa²⁺応答と同様にS1Pによるホスホリラーゼ活性化は増強し、LPAによる酵素の活性化はやや減弱していた。

　Ca²⁺動員アゴニストが細胞内でCa²⁺を動員する際には、多くの場合、PLC-イノシトールリン酸(なかでもIns1,4,5-P₃)産生系が活性化されている。そこで、³H-イノシトールで標識した細胞からの³H-イノシトールリン酸の産生を指標として、PLC活性を測定した。分離直後の肝細胞でS1PとLPAは有意にイノシトールリン酸産生を促した(図2のcとd)。またCa²⁺応答と同様に、S1Pによるイノシトールリン酸産生は初代培養することによって大幅に増加した。しかし、LPAによるイノシトールリン酸産生は初代培養前後においてほとんど変化しなかった。この結果はS1PとLPAは類似のシグナル伝達系を共有しているものの、その初期過程(おそらく受容体が)異なることを示唆している。また、G蛋白質の非選択的活性剤であるNaF応答も培養前後においてほとんど変化しなかった。これらS1P、LPA、NaFによるPLC活性化作用はPTXで細胞を処理してもほとんど影響をうけなかった。

　上述したように、細胞外に投与したS1PのCa²⁺動員に関しては2つの機構が提唱されている。すなわち、細胞内に入り、Ca²⁺プールに直接作用する場合とPLC活性化、IP₃産生を介する場合である。初代培養によってS1PによるPLC活性化、Ca²⁺動員、ホスホリラーゼ活性化がいずれも増強されることから、肝細胞においては後者の機構(PLC活性化経路)が重要と考えられる。この点に関し、さらに検討を加えた。プロテインキナーゼC(PKC)の活性化剤であるPMAによってPLC活性(イノシトールリン酸産生)が阻害されるとCa²⁺応答も阻害された。また、イオノマイシンで細胞内Ca²⁺濃度を上昇させた時、PLCの活性化は起こらなかった。この結果はPLCが細胞内Ca²⁺濃度上昇に基づいて2次的に活性化されたためではないことを意味している。さらに、透過性肝細胞においてMn²⁺クエンチング法によりCa²⁺動員を間接的に評価したところS1PによってCa²⁺動員は観察されなかった。これらの結果はS1PによるCa²⁺動員がCa²⁺プールに対する直接作用というよりはPLC-イノシトールリン酸産生を介したものであることを支持している。

　肝細胞ではcAMPによるホスホリラーゼの活性化経路も存在するが、S1PはcAMP産生に対しては抑制的であった。そこでS1Pのアデニル酸シクラーゼ活性に対する効果を評価するため、フォルスコリンおよびcAMP分解酵素(ホスホジエステラーゼ)阻害剤存在下でのcAMP産生を測定したところ、S1Pは分離直後および24時間初代培養後のいずれの肝細胞においても濃度依存的にその産生を阻害した(図2e)。この場合、PLC系とは異なり、S1Pのアデニル酸シクラーゼ抑制作用は初代培養によって影響をうけず、また百日咳毒素(PTX)処理により解除された。一方、LPAではアデニル酸シクラーゼ抑制作用は観察されなかった(図2f)。

　初代培養時におけるS1PのPLC-Ca²⁺応答の増強は肝細胞が増殖期に入るような低細胞密度で培養した時に観察された。細胞密度を高細胞密度に変えることで肝細胞は培養時にもかかわらず増殖期への移行が抑えられるが、この時、S1PのPLC-Ca²⁺応答の増強も抑えられた(図3)。このように、S1PのPLC-Ca²⁺応答の増強は肝細胞の細胞周期と協調していることが示唆された。そこで、この点をさらに確認するため、2/3部分肝切除により作った再生状態の肝臓から分離した細胞でのS1P応答を検討したところ、S1PのCa²⁺応答が正常肝細胞の応答より約2倍くらい増強していることが確認された。

図3 初代培養時における細胞密度のS1P応答に対する効果