MMMの末梢組織での見かけの増殖性を検討した。Kp,appを静脈接種後からの時間に対してプロットし、殆ど末梢組織に増殖が見られていないことに対して、筋肉はわずかに増加傾向が見られた。一方、CNS中のウイルス濃度の経時変化は末梢組織と対照的に72時間後ではMMMはCNS各部位において高いKp,appとなることが示された(Fig.2)。

　MSMはMMMに近い濃度変化を示した。MSMはnon-capsid geneがMMMと同一のリコンビナントであることから、中枢での増殖性はnon-capsid geneが重要な影響を与えることを示唆している。同時に、Sabin-1株のcapsidを持つウイルスもMahoney株同様に血液脳関門を透過することを示している。このように、PVは血液から中枢組織へ移行していることが明らかとなった。

Fig.2 Time courses of Kp,app values of poliovirus titers in CNS of Tg mice after intravenous inoculation; panel A: cerebrum; panel B:cerebellum; panel C: brain stem; panel D: spinal cord. The symbols represent the mean ± S.E. of four experiments.Key:(●)MMM;(○)SSS;(△)MSM

　Capsid蛋白を[³⁵S]-メチオニン標識したMMM,SSS,MSMをTg21及びICRに静脈内接種し、5時間後の組織対血液中濃度比(Kp,app)を測定しPV組織分布特異性を調べた(Fig.3)。いずれのウイルスにおいても大脳と小脳は最も値が小さいことが示した。今まで、ウイルスの中枢選択的な感染性は初期分布の中枢組織特異性であることを考えられたが、しかし、この結果から、初期分布過程には中枢選択がないことを明らかになった。さらに、Tg21とICR各臓器に対する分布はほぼ一致しており、初期分布はPVRの影響はないことが示唆された。

Fig.3 Comparlson of Kp,app values of [³⁵S]-methlonlne-labeled pollovirus between Tg and ICR mice; panel A: MMM;panel B:SSS.The symbols represent the mean ± S.E. of three experiments. Dotted line represents Y＝X.

　静脈内接種の場合ではLD₁₀₀は6.410⁶pfu/mouseで、ウイルスの初期脳内分布は約10⁴pfu/brainであり、この値は脳内接種時のLD₁₀₀に相当する。この結果から静脈内接種の場合では、見かけ上脳組織へ初期分布したウイルスの大部分が脳内に移行しない限り、中枢毒性が起こらないことを示している。この結果よりPVは効率良くBBBを透過し、中枢組織に移行することが示唆された。それで、[³⁵S]-メチオニン標識したMMM,SSS,MSMの中枢移行性を解析するために、静脈内接種後の血液中とそれぞれの中枢内ウイルス濃度の測定値をもとにintegration plotし、大脳についてPVの透過速度、capsidの役割及びPVRの役割をそれぞれ解析した(Table 1 )。

　MMMについて大脳では0.164l/min/g brainでBBBを透過することが示された。PV粒子の外径は30nmと非常に大きく、この値はBBBの透過速度が非常に小さいアルブミンに比べて100倍以上高いことから、見かけのPVのBBB透過は単なる非特異的な透過や細胞間隙透過では説明できないことを示している。さらに、MMM、SSS、MSMの三者で比較すると殆ど同程度にBBBを透過することが示された。

Table 1 Accumulation rate of poliovirus into the mouse cerebrum

　この結果はワクチン株のSSSも強毒株のMMMと同様に中枢内に移行するということを示しているので、SSSもウイルス血症になった場合には、強毒株MMMと同じ速度でに中枢内へ移行する可能性を示唆している。さらに、MMM,SSSについてICRとTg21間でのBBB透過速度を比較すると、両者はほぼ同じ値である。したがって、PVRがBBB透過性の支配要因ではないことが示唆された。

　Integration plotの結果をサポートするために、capillary depletion法と呼ばれる方法で脳を毛細血管と実質部位に分離し、PVがBBBを透過して脳実質組織部位に到達したことをさらに検討した。または、PVはcapillaryで複製してBBBを透過するか、intactのままで透過するかなど、ウイルスが脳内に入るメカニズムを検討した。capillary depletion法を用い、[³⁵S]-標識したMMM,またはSSSをTg21またはICRマウスに静脈内接種後2時間及び7.5時間後の脳内皮細胞と実質細胞への分布性をRI count及びプラークアッセイで評価した(Fig.4)。実験結果から、いずれのウイルスはparenchymal fractionにrichであることが示唆された。さらに、sucrose gradietion遠心法を用い、Capillary depletion法で得られた実質fractionをsucrose gradietion遠心法を用い、ウイルス粒子の状態を調べた。結果として、大脳に移行したウイルスの大部分はintactのものであることが確認した。以上のことから、PVはintactのままBBBを透過して循環血液から脳実質組織へ移行していることが示唆された。

Fig.4 Time courses of Kp,app values of [³⁵S]-methionine-labeled poliovirus in the brain parenchyma and capillary after intravenous inoculation;panel A and C:Tg mice;panel B and D:ICR mice. Panel A and B:MMM Panel C and D:SSS.The symbols represent the mean ±S.E. of five experiments.Key:(●)parenchyma fraction;(○)capillary fraction

　脳内接種後のLD₅₀値を比較するとSSSのLD₅₀はMMMのLD₅₀の値1000倍以上高く、MMMの毒性はSSSに比べて圧倒的に強いことが示された(Table2)。さらに、MSMとSMSではMSMのLD₅₀がMMMに近いことから、毒性はnon-capsid gene、つまり、ウイルスの増殖性が中枢毒性の最も大きな要因であるというこれまでの考えを一致した。

Table 2 LD₅₀ and approximate minimum LD₁₀₀ of poliovirus in Tg mouse

　ウイルス粒子は生体内で崩壊することが知られているが、脳内での安定性も見かけの毒性に大きな支配要因となることが考えられ、これらの点について検討した(Fig.5)。Tg21.ICRに脳内接種した後の各ウイルスの脳内濃度の経時変化を測定したところ、Tg21において、MMMはこの場合、非常に速い増殖性を示しているが、SSSの方は見かけ上減少していく結果が得られた。

Fig.5 Comparison of poliovirus titers in the cerebrum after intracerebral Inoculation among MMM,SSS and MSM

　このようにnon-capsid geneに依存した脳内での増殖速度が毒性を支配する最も大きな要因と思われる。さらに、PVRが介しない状態で、すなわちICRマウス用い各ウイルスの脳内安定性を調べた。見かけ上MMMの傾きはSSSより小さく、一方、SSSとMSMの傾きはほぼ等しい値が得られた。MSMとSSSはcapsidが同じであることから、脳内での安定性にはcapsidが支配的であり、Mahoney typeのcapsidがSabin typeに比べて約4倍安定であることが示された。