天然有機化合物の立体化学は、作用機構や構造活性相関を検討する上での不可欠の情報として、その重要性が増してきている。しかし、従来のNMR手法ではNOEや³J_H,Hをもとに小員環部分の相対配置を決定できるものの、鎖状部分などの立体配置に関してはNMR以外の方法(X線結晶構造解析や分解誘導化、立体異性体の合成など)に頼らざるを得ないのが現状である。というのも、複数の立体配座が存在しうる鎖状化合物ではNOEの解釈が著しく困難となり、多くの場合NMRでは立体配置決定に到らないためである。また、NMR以外の方法にも種々の制約が伴うため、現実に多くの天然有機化合物の立体配置が未解明のまま残されている。

　そこで、NMRによる天然物鎖状部分の相対立体配置の決定法を開発すべく本研究を行った。まず、新たなNMR情報として遠隔C-Hスピン結合定数(^2,3J_C,H)に着目し、鎖状部分によく見られる隣接する不斉炭素、およびメチレンを挟んだ不斉炭素の相対立体配置の解析方法を考案した。同時に^2,3J_C,Hの測定法についても検討を加え、この実用を可能とした。さらにこの方法を用い、マイトトキシン、アンフィジノール3、およびゾーザンテラトキシンの鎖状部分の立体配置決定を行った。

　²J_C,HはHと酸素官能基(OR)との二面角に、また³J_C,HはC/H間の二面角に依存することが報告されている。図1に、これらの関係がゴーシュおよびアンチ型をとった場合の典型的な^2,3J_C,Hの値を示した。以下、これらの値をその絶対値の大きさにより、LargeおよびSmallと表す。

図1 スピン結合定数の角度依存性²J_C,Hは当該¹³Cに酸素官能基が置換した場合に二面角依存性を示す。()内は酸素原子2つが1,2置換した場合の値

　これらの二面角依存性をもとに、まず隣接する不斉炭素間の相対配置について検討した。不斉炭素2つが隣接した場合、ジアステレオマーA,Bそれぞれにつき3つ、合計6つの回転配座が考えられる。これらそれぞれに予想されるスピン結合定数の大きさを図2に示した。この図より、6つの回転配座のうち、A-1,A-2,B-1,およびB-2についてはスピン結合定数の組み合わせがお互いに異なっており、これから各々が区別できる。例えば、観測された³J(H-2,H-3),³J(H-2,C4),³J(Cl,H-3)の値がそれぞれSmall,Large,Largeであった場合、あてはまるのはA-2のみであり、その相対配置はAすなわちトレオ体であると一義的に決定できる。ここでA-3とB-3の回転配座は、スピン結合定数の組み合わせが同じとなるため区別できないが、C1/C4が一方ではゴーシュ型、他方ではアンチ型になるので、これらの炭素上の¹Hに関するNOEにより解決可能である場合が多い。

図2 隣接する不斉炭素に可能な6つの回転配座および予想されるスピン結合定数の大きさ

　メチレン炭素上のジアステレオトピックな水素について両側の不斉炭素との間で回転配座の帰属を同様に行えば、メチレンを挟んだ2つの不斉炭素の立体配置を関係づけることもできる。また、鎖状構造によくある二配座混合系においても、後述のようにこの方法が適用可能である。

　本研究での^2,3J_C,Hの測定は、既報のhetero half-filtered TOCSY(HETLOC)法を主に用いた。この測定法はHOHAHAに似たスペクトルを与えるが、各¹H-¹H相関ピークはF1軸方向に¹J_C,Hで分裂し、F2軸方向に^2,3J_C,Hでずれた形状をしている(図3)。したがって、このずれから^2,3J_C,Hの値を決定できる。ただし、HETLOC法はHOHAHAによる磁化移動を用いているため、四級炭素を含む場合や¹H-¹Hスピン結合定数が小さい場合には適用できない。そこで、Baxらによる位相検出HMBC法と併用することにした。

　位相検出HMBCスペクトルにおいて、ある水素(H)と炭素(Ca,Cb)との相関ピークの相対強度(I_C3,H/I_Cb,H)は以下の式で表すことができる。

　ここで、J_Ca,HがHETLOC法により既知であれば、J_Cb,Hはこの相対強度から算出される(図4)。すなわち、HETLOCから得られた^2,3J_C,H値と位相検出HMBCの相関ピーク強度比の併用によって、さらに多くのJ値を得ることが可能となった。また、より効果的な^2,3J_C,Hの測定のために、これらに関連した測定法(例えば対角シグナルを消去したHETLOC法や,low-pass J filterを導入し¹J_C,H由来のシグナルを消した位相検出HMBCなど)も併用した。

図3 オカダ酸のHETLOCスペクトル

図4 オカダ酸の位相検出HMBCスペクトルのスライス図HETLOCにより得られた²J(C4,H-3^pro-R)の値を基に、位相検出HMBCの相関ピーク強度比と式1から、他の2つのスピン結合定数を決定した。

　上述のように、^2,3J_C,Hによる二面角情報の導入により、有機化合物の相対立体配置を比較的少量の試料で決定可能となった。そこで、天然有機化合物中最大の分子量(3422Da)を有するマイトトキシン(MTX)に本方法を適用し、既法では解析不可能であった両末端鎖状部分(C1-C15およびC134-C142,図5)の相対立体配置の帰属を試みた。測定試料として、¹³Cの同位体含量を4%にユニフォームエンリッチしたMTX(9mg)を用いた。

図5 マイトトキシンの両末端鎖状部分

　MTXのC5-C6結合に関する3つの回転配座と予想されるスピン結合の大きさを図6Aに示した。実測値は、H-5/H-6^lとH-6^h/5-OHが共にアンチになることを示しており、C5-C6の回転配座はIであることが明らかとなった。同様にしてC6-C7結合に関する回転配座を特定した(図6B)。帰属されたメチレン水素に基づきA-IとBをつなげることで、C5とC7の相対立体配置を決定した。

図6 A.MTXのC5-C6に考えられる回転配座(I-III)のスピン結合の大きさと実測値B.実測値に基づくC6-C7の回転配座^*H-6^h,H-6^lはそれぞれ1.62,2.09ppmのプロトンを表す

　NOEデータおよび中間的な³J_H,H値から複数の回転配座の共存が示唆されたC7-C8およびC8-C9部分に関しては、平衡に関与する配座を特定することで相対立体配置を決定した。すなわち、C7-C8部分については、得られた中間的な³J_H,H,²J_C,Hとゴーシュに典型的な³J_C,Hを満足するのは、両ジアステレオマーを含めて図7Aに示す一組の配座平衡のみである。同様にC8-C9部分の相対立体配置を配座平衡の特定により決定した(図7B)。以上の結果、C5-C9部分の相対立体配置を5R^*,7R^*,8R^*,9S^*と決定した(図8)。

図7 MTXのC7-C8(A)およびC8-C9(B)におけるスピン結合定数と可能な交換配座^**1,2置換した酵素官能基により、Bの²J_C,Hは典型値に比べて正方向に1-2Hz移行している(図1参照)。

　C1-C15の残り部分については、C9-C12のNOE解析およびC12-C15の本法による解析により、C13-C14を除く全ての相対配置を特定できた。これに基づき、C13-C14に関する2種類のジアステレオマー・モデル化合物が共同研究者により合成され、天然物とのNMRデータの比較によって立体配置が決定された。もう一方の鎖状部分(C134-C142)についても、C134-C138の相対立体配置を本法により特定できた。多スピン系のためピーク強度が弱く解析困難だったC138-C139部分に関しては、可能な4種類の立体および光学異性体が共同研究者により合成され、絶対立体配置も同時に決定された。これにより絶対配置を含むマイトトキシンの全立体化学が決定された(図8)。

図8 NMR解析および有機合成から決定されたマイトトキシン両末端鎖状部分の絶対立体配置

　渦鞭毛藻Amphidinium klebsiiより単離され平面構造が決定されたアンフィジノール3の立体配置についても同様に検討を行った。NaH¹³CO₃添加条件にてA.klebsiiを200L培養し、¹³Cが約25%にエンリッチされたアンフィジノール3(8mg)を調製した。本化合物に上記のNMR解析を行い、図9に示す相対立体配置を決定した。

図9 A.アンフィジノール3の相対配置(C27/C32の関係は不明)B.スピン結合定数より得られたC20-C27部分の立体構造 C24-C25についてはNOEを考慮して帰属した。

　これら以外にも、この方法論を用いて渦鞭毛藻由来のゾーザンテラトキシン加水分解物の相対立体配置を決定した。このように、C-H間のスピン結合定数を新しい情報として用いることにより、従来困難であった非環状化合物のNMRによる立体構造解析が初めて可能となった。