ペプチド:N-グリカナーゼ(PNGase)は、図1に示す反応を触媒する酵素である。即ち、糖タンパク質N型糖鎖の根元のGlcNAc残基とAsn残基の間のアミド結合を切断し、最終的に還元末端にN,N’-ジアセチルキトビオース構造を保持した遊離糖鎖と糖結合Asn残基がAsp残基に変換した脱糖鎖タンパク質を等モル量生じる。

図1.PNGaseが触媒する糖タンパク質N型糖鎖脱離の反応R₁:オリゴ糖鎖;R₂,R₃:ペプチド鎖

　本酵素活性は1977年高橋によってアーモンド中に見い出されて以来細菌からも単離され、N型糖鎖の構造及び機能研究に有用な試薬として広く用いられてきた一方で、酵素自体の生物学的機能については長い間注目されることが無かった。

　PNGaseの動物細胞における存在例は1991年に瀬古らによってメダカ胚に見い出されたのが最初である。以来、我々は本酵素の触媒するDe-N-glycosylation反応をタンパク質の翻訳後の再修飾反応(remodification)として位置づけ、この反応が実際に生体内で基質糖タンパク質の物理化学的、あるいは生理学的性質の変化を通じてその機能発現および調節に関与していることを提唱してきている(図2)。

　私は本研究科修士課程において本酵素活性の微量な活性同定、検出法を確立した。この検出法によって、PNGaseは様々な組織および培養細胞の可溶性画分に存在し、活性の至適pHが中性であること等を明らかにした。本研究はこの動物細胞に遍在するPNGaseの生理機能を解明することを目的として行われ、以下の[1]から[3]に示す結果が得られた。

[1]L-929PNGaseの完全精製及び酵素学的諸性質

　マウス由来の繊維芽細胞であるL-929細胞の可溶性画分に見い出されたPNGaseを疎水性クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーによって完全精製し、L-929PNGaseと名付け、酵素の諸性質を調べた。本酵素は糖鎖を持たず、分子量はゲル濾過の溶出位置から212,000と推定され、SDS電気泳動の移動度からは105,000と見積られた。このことから本酵素は単一サブユニットのホモダイマーを形成していることが示唆された。また、本酵素活性はジチオスレイトール等の還元剤要求性であり、モノヨード酢酸やN-エチルマレイミドは活性を阻害することから、活性の発現に-SH基が関与していると考えられた。

図2N-Glycosylation/de-N-glycosylation機構の概念図N-glycosylationは翻訳と同時におこり、タンパク質の安定性や生理活性の発現に寄与しているが、PNGaseの触媒するde-N-glycosylationも翻訳後の再修飾機構として同様に糖タンパク質の機能発現およびその調節において重要な素過程を構成する。

　L-929PNGaseの至適pHは7.0であり、酵素の反応産物である遊離糖鎖によって活性が阻害される等、既知のPNGase(アーモンド由来PNGaseA;Flavobacteriummemingosepticuum由来PNGase F)とは異なる性質を示した。また本酵素は2価陽イオンを要求せず、Zn²⁺,Cu²⁺,Fe³⁺の各種イオンによって阻害をうけた。また、糖アスパラギンによっても強い阻害をうけた。至適イオン強度は0.05であった。温度依存性については、30℃で活性の最大値を示し、その安定性は、37℃以上で安定性の急激な低下が見られた。

　L-929PNGaseの¹⁴C標識フェツイン糖ペプチドIに対する反応速度論的解析を行ったところ、Lineweaver-Burkプロットは直線性を示し、グラフよりK_m値は114Mと求められた。同一基質を用いてPNGase AおよびPNGase FのK_mを求めて比較したところ、それぞれ1.46mMおよび525Mと求められ、L-929PNGaseがこれらと比較して基質との高い親和性を持つことが示唆された。

　L-929PNGaseは高マンノース型、混成型、複合型糖鎖を持つ糖ペプチドに作用し、幅広い基質特異性を示したが、根元のGlcNAcに1→3或いは1→6でFucが結合している基質には反応性を示さなかった。また糖鎖部分がGlcNAc1残基のみの糖ペプチドや糖アスパラギンには全く作用しなかった。糖タンパク質に対する反応性については4種類の基質(ウシ膵臓リボヌクレアーゼB、ウシ胎児血清フェツイン、ヒト血清トランスフェリン、ニワトリ卵白オボアルブミン)に対して調べたところ、糖鎖の切断は確認されなかった。

　本論文は5章からなり、第1章は序章として以下の研究の背景について述べ、第2章はL-929細胞由来のペプチド:N-グリカナーゼ(L-929PNGase)の完全精製及び酵素学的諸性質、第3章L-929PNGaseの糖鎖結合活性、第4章はニワトリ輸卵管PNGaseによる内在性基質の部位特異的糖鎖脱離について述べられ、第5章は結語が述べられている。PNGaseは、糖タンパク質N型糖鎖の根元のGlcNAc残基とAsn残基の間のアミド結合を切断し、遊離糖鎖と糖結合Asn残基がAsp残基に変換した脱糖鎖タンパク質を等モル量生じる加水分解酵素である。本酵素活性は1977年高橋によってアーモンド中に見い出されて以来細菌からも単離され、N型糖鎖の構造及び機能研究に有用な試薬として広く用いられてきた一方で、酵素自体の生物学的機能についてはほとんど明らかにされていない。PNGaseの動物細胞における存在例は1991年にメダカ胚に見い出されたのが最初である。以来、酵素の触媒する反応をタンパク質の翻訳後の再修飾反応として位置づけ、この反応が実際に生体内で基質糖タンパク質の物理化学的、あるいは生理学的性質の変化を通じてその機能発現および調節に関与していることが提唱されてきている。本研究は論文提出者を中心として確立された本酵素活性の微量な活性同定、検出法によって、これまでにPNGaseが様々な組織および培養細胞の可溶性画分に存在し、活性の至適pHが中性であること等が明らかにされてきた経緯を踏まえ、この動物細胞に遍在するPNGaseの生理機能を解明することを目指し行ったものである。

　第2章及び方法において、哺乳動物に新たに見出されたPNGaseを培養細胞より精製し、その性質の詳細を明らかにしている。即ち、第2章ではマウス由来の繊維芽細胞であるL-929細胞の可溶性画分に見い出されたPNGaseを疎水性及びゲル濾過クロマトグラフィーによって完全精製し、L-929PNGaseと名付け、酵素の諸性質を調べ、本酵素は糖鎖を持たず、本酵素は単一サブユニットのホモダイマーを形成していることを示し、また活性の発現に-SH基が関与していることを明らかにしている。その他、活性の温度やpH依存性及び安定性、様々な糖ペプチド基質に対する基質特異性、同一基質に対するKmの、他の既知のPNGase(アーモンド由来PNGaseA;F.memingosepticuum由来PNGase F)との比較等、酵素学的諸性質が明らかにされている。動物細胞由来のPNGaseが精製SDS-PAGEで単一成分にまで精製され、酵素の性質の詳細が解明されたのは、初めてのことである。引き続き第3章では、第2章におけるL-929PNGaseの諸性質の検討の際、他の酵素と比較して特異的に見い出された糖鎖結合タンパク質としての性質について、更に詳細な解析がなされている。その結果、糖鎖の種類(高マンノース型、複合型)によらず酵素はN型糖鎖のコア構造であるトリマンノシド-N,N’-ジアセチルキトビオース構造を持つ糖鎖と強く結合し(K_d＝〜10^-5M)、ダイマー酵素あたり2箇所の結合部位を持つことを明らかにしている。この糖鎖結合活性によって酵素活性は阻害されるものの、速度論的解析によって糖鎖が結合している状態でも酵素が働きうる事を示している。このことから、このL-929PNGaseの糖鎖結合タンパク質としての性質は、酵素のFeedback Inhibitionに関与しうる他、生体膜や他の分子との相互作用によって酵素活性の制御を行っている可能性を示している。

　第4章では、動物細胞の可溶性画分に普遍的に存在するPNGaseの生物学的機能を知る為に、酵素の内在性基質の候補タンパク質として通常その分子中にN型糖鎖を1本持つオバルブミンに着目している。即ち、以前にオバルブミンの一部が生合成の過程で一過的に糖鎖を2本持つ分子(OG-OVA)として合成されることが知られていたことから、OG-OVAが消失する過程にPNGaseの反応が関与しているのではないかという仮説に基づき、ニワトリ輸卵管に存在するPNGaseとオバルブミンの生合成過程におけるこの酵素の関与について検討している。その結果、この酵素反応によってOG-OVAから糖鎖の脱離が部位特異的に起こり、専らOG-OVAにおいて余分に付加された糖鎖が外れていることを明らかにしている。このことから、可溶性中性PNGaseの生物学的機能として、糖鎖の過剰修飾を受けた異常タンパク質を正常の機能性タンパク質に修復する、あるいは分解経路に導くという役割を持つこと、即ち糖タンパク質の新しい品質管理機構に関与する可能性を提唱している。第5章においては、結語として糖鎖脱離の現象はN型糖鎖の例に限らず、全ての複合糖質においてその重要性を再評価する必要性を説いている。

　以上の本論文の成果によって、これまで全く未知であった可溶性、中性のPNGaseの詳細な性質を解析し、その生理機能についての新たな仮説を提唱する状況証拠を得るに至っている。この仮説はタンパク質の生合成における品質管理機構と本酵素との関与を示唆するものであり、酵素の真核生物における普遍的な重要性を解明するための基盤を確立したといえる。従って、本論文の著者は理学博士の学位を受ける資格があるものと認める。

　なお、本論文の第2章及び第3章は、既に3篇の共著論文として発表されており、第4章は1篇の共著論文として投稿中であるが、いずれにおいても論文提出者は主要な寄与をしたものであることが認められる。