グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)は、分子量20-25kDaのサブユニットがホモもしくはヘテロ二量体を構成してできた多機能蛋白質である。GSTは主としてグルタチオン(GSH)と求電子性基質との抱合反応を触媒し、解毒代謝に関わる。哺乳類由来GSTでは、X線結晶構造解析及び部位特異的変異法による解析から、N端近傍のチロシンのhydroxyl基がGSHのthiol基の求核性を高める事によってGSH抱合反応が触媒されると推測されている¹⁾。真核生物では多様な生物種からGSTが単離、研究されている一方、原核生物においてはGSTの構造は基より存在の普遍性についても明らかでない。そこで本研究では既知のファミリーとは最も遠縁の大腸菌よりGSTを精製、クローニングし、そのX線結晶構造解析を通じてGSTファミリーの構造・機能相関の分子進化を解明する事を目的とした。

　大腸菌K12株よりDE-52及びGSHアガロースカラムを用いてGSTを高純度精製した。そのN端アミノ酸配列を基にThe Escherichia coli Gene Mapping Membrane(宝酒造)を用いてGSTの構造遺伝子をクローニングした²⁾。その結果、本酵素の遺伝子は大腸菌染色体上約1731kbに位置し、201アミノ酸残基(22,860Da)からなる事が明らかとなった。本酵素の遺伝子をpUC18プラスミドベクターに挿入して発現させたところ、培地1lあたり約100mgの産生量を得た。

　高発現した大腸菌由来GSTをGSHアガロースカラムで精製した。基質類似阻害剤のグルタチオンスルフォネート存在下で沈澱剤としてPEG6000を用い、酸性条件(pH4.6)で単結晶を得、これをMacro-seedingによって0.8mm×0.5mm×0.1mmまで成長させた。この結晶は2.1Å分解能までの回折斑点を与え、空間群P2₁2₁2₁、a＝90.56Å、b＝95.65Å、c＝51.21Å、溶媒含量は49%で非対称単位にホモダイマー1分子を含む。Native結晶については10個の結晶を用い、回転対陰極型X線発生装置で発生させたCuK_a線を用い、イメージングプレートを使った読み取り装置一体型振動カメラにより2.1Å分解能までの回折強度データを収集した(Table1)。次に3種の重原子置換体結晶を用いた多重同型置換法により初期位相を得た(Table1、2)。溶媒領域の電子密度図の平滑化と非結晶学的二回軸を利用したダイマーの電子密度の平均化で改良した2.8Å分解能の電子密度図を基にして構造の初期モデルを組み立てた。X-PLORで精密化した402アミノ酸残基とインヒビター2分子、水分子179個からなる構造モデルに対するR因子は18.2%となった(Table3)。

Table1.Data collection statistics

Table2.Summary of phasing statistics

Table3.Refinement statistics

　本酵素はホモ二量体であり、ダイマー分子全体としては球状で、その大きさは58Å×56Å×52Åである(Figure1)。モノマー分子はN端側(1-80残基)とC端側(89-201残基)の二つのドメインから構成されている(Figure2)。N端側ドメイン(1〜2)は2枚の-sheetと2本の-helixからなり、その中核はモチーフを構成する。又、そのC端側ドメインは5本の-helixからなり(3〜7)、これらが反時計周りに螺旋状に並んでいる。N端側ドメインの1、2及びC端側ドメインの3、5は密に接触しており、ダイマー分子全体の中核となっている。GSH結合部位を構成する溝はN端側ドメイン上に存在し、その底部は1と1間のループと5と2間の折り返し部分からなる。インヒビター分子は、その-glutamyl基を蛋白質分子内部に、glycyl基を外部に配向して結合しており、特に-glutamyl基と蛋白質分子の間に8本の水素結合からなる強い相互作用が認められる。触媒機構上重要なGSHのthiol基に対応するsulfonate基は1と1間のループ上に位置し、その酸素原子が1と1間のループに存在するCys10の主鎖の窒素原子及び3に存在するHis106の原子と水素結合を形成している(Figure3)。

Figure1(左図)ダイマー全体を、各モノマーを関係づける二回軸に対し平行な方向より見たリボン図。インヒビター分子はball and stickモデルで表す。 Figure2(右図)モノマー分子を、二回軸に対し垂直方向から見たリボン図。

　本酵素の真核生物由来のGSTに対する1次構造上の相同性は18%以下であるにも関わらず、基本構造はそれらのGSTとトポロジー的に類似している。他方、2と4間の領域の構造や、3及び4が隣接サブユニットの両-helixと相互作用を形成している為、サブユニット間の接触が密である事などは大腸菌由来GSTの特徴である。又、哺乳類由来GSTのC端部分はGSHと反応する求電子性基質の結合部位を覆っているのに対し、本酵素のC端部分は短く、推定上の求電子性基質結合部位は溶媒に対してより開いている。他方、本酵素のGSH結合部位には既知のGSTの特徴が高度に保存されている。すなわち、Pro53のcis型のコンフォメーションやGlu65の主鎖の屈曲は、GSH結合部位の構造形成に重要であり、他のGSTでも保存される。又、Val52、Gln51、Gly66及び隣接サブユニットに存在してGSH結合部位に側鎖が突出しているThr103とGlu104などのアミノ酸残基は、他のGSTでも立体構造上同様の位置に保存もしくは類似の残基に置換され、GSHとの結合に関わっている。こうした全体構造及び触媒部位の相同性に関わらず、哺乳類由来GSTにおいて1のC端近傍に位置し、触媒に直接関与するとされるチロシンは本酵素ではGSH結合部位近傍に存在しない。大腸菌由来GSTにおいて触媒チロシンに相当する残基はTyr5であるが、Tyr5のフェニルアラニンへの置換は酵素活性に影響を与えなかった²⁾。本酵素においては、チロシンに代わってCys10の主鎖の窒素原子或いはHis106の原子が水素供与体としてthiol基のアニオン型を安定化するか、或いはHis106の原子がthiol基の水素を受け取る事によってその求核性を高めていると考えられる。本研究によって、GSTファミリーは同一の起源から進化した共通のフォールディングと機能を持つにも関わらず、その触媒機構に関しては種によって重要な相違が存在する事が示唆された。

Figure3 GSH結合部位のステレオ図。インヒビター分子とCys10及びHis106(太線)との間の水素結合を破線で示した。