大腸菌RecAタンパク質は生体内で遺伝的組換えに必須であり,そのホモログは広く人間にまでわたって存在している.RecAタンパク質は,ATPを補助因子とし,単鎖DNA上に協同的に結合し,フィラメント状の前駆体を形成する.その前駆体は,他の二重鎖DNAとの間で,相同的塩基配列を探索し,対合させ,相同なDNA鎖を交換する反応を促進させる.

　RecAタンパク質については単独あるいはADP複合体でのX線解析の例はあるが,DNAとの複合体での構造解析例は未だ報告されてない.RecAタンパク質-DNA複合体についての電子顕微鏡の観察によると,RecAフィラメント内の単鎖及び二重鎖DNAはB型DNAの1.5倍に引き延ばされ,約18.6bp/turnに巻き戻されて見える.しかし,実際のタンパク質-DNA間の相互作用は水溶液中の運動の激しい条件下で起こる現象であり,そのような動的性質を含んだ情報はX線解析,電子顕微鏡では得られない.生理的条件下で実際に行われている相同対合の分子機構を理解するためには,水溶液中でのNMRによる解析が必要である.ところが,RecAタンパク質あるいはRecAタンパク質とDNAの複合体のような巨大分子をNMRによって解析することはシグナルのブロードニングを招き,共鳴線の分離が困離となる等,大きな困難を伴う.事実,RecAタンパク質あるいはそのDNA複合体をNMR実験の対象として成功している例は,これまで一例もなかった.

　RecAタンパク質はDNAの周りを高い協同性で多量体形成し,安定な複合体を作るが,DNA自身との結合は非常に弱く,特に短いDNAオリゴマーとのアフィニティは非常に低いことが知られている.我々は,この性質を利用することによって,RecAタンパク質とDNAとの相互作用をNMRによって解析することができると考えた.すなわち,基質として短いDNAオリゴマー(3-6塩基)を用い,DNAが速い速度で結合・解離する化学交換の存在下でNOE測定を行うtransferred nuclear Overhauser effect(TRNOE)実験を行うことによってRecAタンパク質に結合したDNAの構造情報を得ることができると考えたわけである.この手法は小分子が速い交換速度で巨大分子と結合・解離をおこしている実験系において幅広く適応され,巨大分子に結合した小分子の構造を解析することに有用であることが示されている.

　DNAオリゴマーとATPSとを含む溶液にRecAタンパク質を加えることにより,1DNOE差スペクトル上でTRNOE由来のシグナルを観察した(図1a).これらのNOEはRecAタンパク質添加前は非常に小さいものであり(図1c),RecAタンパク質によって誘起されたものである.RecAは補助因子としてADPを用いるとDNAに対して,親和性が減少することが知られている.実際にATPSをADPに置換することによって,TRNOEの強度が抑制された(図1b).このことは,結合状態のDNAオリゴマーのフラクションがATPSをADPに置換することによって減少したことを示唆する.また同様に,RecAタンパク質はRNAに対して,親和性が低いことが実験によって示されている.我々はDNAをそれに対応する塩基配列を持つRNAに置換することによってTRNOEシグナルの強度が有意に減少することを観察した(図1d)

図1 d(TGACAT)/RecAの1DTRNOEスペクトル

　RecA-DNA溶液のTRNOESYスペクトルには典型的なB型DNAやA型DNAに観察されるものとは異なったクロスピークが示されている.典型的なB型DNAのNOESYスペクトルにおいては,H1’(i)とH8/H6(i+1)との間に強いクロスピークが,H3’(i)とH8/H6(i+1)との間に弱いクロスピークが観察されるはずである.それに反して,2DTRNOESYスペクトルには残基間のH1’(i)-H8/H6(i+1)クロスピークは非常に小さく,一方,残基間のH3’(i)-H8/H6(i+1)クロスピークは異常に強いものであった(図2b).A型DNA構造は強い残基間クロスピークH2’(i)-H8/H6(i+1)によって特徴づけられるが,我々はほぼ同じ強度の比較的弱い残基間H2’(i)-H8/H6(i+1),H2"(i)-H8/H6(i+1)NOEを観察した(図2a).これらは典型的なA型あるいはB型DNAに期待されるものとは著しく異なるもので,RecAタンパク質に結合した単鎖DNAが特異的な構造をとっていることを示している.

図2 d(TGACAT)/RecAの2DTRNOEスペクトル

　残基内のH8/H6-H2’,H8/H6-H1’,H8/H6-H3NOEは塩基の配向と糖のパッカリングを決定するのに重要なクロスピークである.残基内のH8/H6-H2’NOEの強度は残基内H8/H6-H1’,H8/H6-H3’NOEに比べて,より強い.このことはRecAに結合したDNAは主にS-type(C2’-endo樣),anti構造を取っていることを示している.しかし,残基内H8/H6-H1’,H8/H6-H3’NOEは純粋なC2’-endo,anti構造に期待されるものよりもより強いため,C3’-endoやsynコンフォメーションがいくらかTRNOESYスペクトルに寄与していると考えられる.そこで,RecAタンパク質に結合したDNAがC2’-endoとC3’-endo,antiとsyn構造の混合状態にあると考え,各々の構造をモデリングし,緩和行列計算を行った.さらに,実際のTRNOEbuildupcurveに対してフィッティングを行うことにより,それぞれの構造のTRNOEスペクトルに対する寄与を評価した.その結果,フラノース環のパッカリングとグリコシジル結合角をC2’-endoとC3’-endo,antiとsynそれぞれ適当な比率で計算することによって,実測値と良く合った結果を得ることができた.結合状態の構造として一型を仮定した計算結果に比べて,実測値と理論値の適合性は非常に良く改善された.

　図3にTRNOEデータから導かれたRecAタンパク質に結合したDNAの構造モデルを示す.最も顕著な構造上の特徴はそのスタッキング様式にある.典型的なDNAでは塩基と塩基との間がファンデルワールス接触しているのに対し,RecA結合型DNAではデオキシリボースのC2’-H2’-H2"部位が次の残基の塩基部位の上方に位置している.このdeoxyribose-baseスタッキング相互作用は疎水的相互作用によって構造全体の安定化に寄与していると思われる.もし,RecAフィラメントに対するらせん軸を塩基面とほぼ垂直に設定すると,塩基間の距離は約5Åとなり,これはB型DNAの約1.5倍に相当する.

図3 RecA結合型DNA.(左)C2’-endo,anti型.(右)最初の残基をC3’-endo,anti型に置き換えたもの.

　緩和行列解析の結果,RecAタンパク質に結合したDNAは溶液中で複数の異なる構造を移り変わっていることが示された.我々はこのうち,糖のパッカリングがS-type(nearC2’-endo)とN-type(nearC3’-endo)との間を移り変わる相互変換がDNAの引き伸ばされた構造中で頻繁に起こっており,このことが相同認識や鎖交換反応の過程で必要な塩基の回転と密接な関連があると考えている.

　現在の生物の殆ど全てはDNAを遺伝情報伝達物質として用いている.RNAをゲノムとして用いている例はRNAウイルス等,僅かな例に過ぎない.この理由として,RNAには無いDNAのH2"がDNAに化学的安定性をもたらし,それゆえDNAの方が遺伝情報保存の場として有利であるという説明が,広く受け入れられてきている.我々の結果はデオキシリボースのC2’-H2’-H2"部位と次の残基の塩基部位との残基間相互作用がDNAの引き伸ばされた構造の主要因であり,相同組換え反応を効率よく遂行させる鍵であることを示唆している.遺伝情報の保存という役割に加えて,DNAのH2"は遺伝子の再編成と多様化(つまり,遺伝的組換え)においても重要な役割を担っているのではないだろうか.我々はこの立体化学的利点が進化の過程で遺伝物質に要求されたのではないかと想像している.そしてそれはDNAに内在しているものであったのだが,RNAには無かったものなのであろう.