修士課程において、rer1-2変異を相補する野生型遺伝子RER1のクローニングを試み,188アミノ酸からなる膜4回貫通タンパク質をコードする新規の遺伝子を同定した.そこでまず,この遺伝子産物について解析するために,Rer1pのC末端にHAエピトープを結合したタンパク質をコードする遺伝子(RER1-3HAを構築した.このRER1-3HAは,単コピーでrer1-2変異を相補した.そこで,このRER1-3HA遺伝子産物の細胞内局在を,間接蛍光抗体法によって解析したところ,小胞体や液胞は染色されず,酵母のゴルジ体の染色像に典型的なドット状のパターンが観察され,また,ゴルジ体に主に局在することが知られるYpt1pの染色像と2重染色においてほぼ一致した(図2).さらに,細胞分画法による解析からゴルジ体シス領域に局在するOch1pと同様の挙動を示すことが明らかとなった(図3).これらのことから,Rer1pは,シスゴルジ体膜に局在し,静的残留というよりもむしろSec12pをゴルジ体から小胞体へ戻す逆送過程に関与していると考えられた(Sato et al.,1995).

　次に,Rer1pの機能の一般性を知るために,Sec12p以外の小胞体膜タンパク質についても解析を試みた.機能的にはたらくSec12p-Mf1p融合タンパク質(S12Mp)に加えて,Sec12pとは正反対のトポロジーをとるSec71p,3回膜を貫通しているSec63pについて新たにMf1pとの融合タンパク質を構築し,それぞれMS71Hp,MS63Lpと名づけた(図4).Sec71pとSec63pはともに小胞体におけるタンパク質の膜透過に働く因子で,Sec12pと同様に上述のような既知の小胞体局在化シグナルは持っていない.構築したMS71Hp,MS63Lpは細胞内で十分に発現しており,定常状態において大部分が小胞体に局在していたことから,以後これらの融合タンパク質を細胞内モニターとして解析を行った.まず,野生株,rer1遺伝子破壊株におけるMS71HpあるいはMS63Lpの挙動をハローアッセイによって調べた(図5).驚いたことに,MS71Hp,MS63Lpともにrer1遺伝子破壊株において成熟型接合因子の分泌によるハローを形成したことから,これらの小胞体局在にもまたRer1pが重要であることが明らかになった.一方,たとえ野生株であってもMS71Hp,MS63Lpを多コピープラスミド上で過剰発現したときは,ハローを形成した.このことから,これらのタンパク質の小胞体局在化の機構には量的な制限因子が存在し,それが飽和していると予想された.

　MS71Hpの過剰発現によってその一部がゴルジ体トランス領域まで輸送されてしまうことが明らかになったので,Rer1pがその制限因子である可能性について検証した.もし,Rer1pが制限因子であるならば,Rer1pの発現量も同時に増加させることによって,過剰分のMS71Hpによる成熟型接合因子の分泌が抑制されると思われる.実際に,Rer1pは単コピープラスミド上で80%,多コピープラスミド上で50%にまで過剰なMS71Hpによって生じる成熟型接合因子の分泌を抑制した(図6).このことから,Rer1pがMS71Hpの小胞体局在化における制限因子の一つであることが示唆された.一方,液胞膜タンパク質Dap2pとMf1pの融合タンパク質DDDmに対してはむしろ成熟型接合因子の分泌を促進する傾向が見られたことから,Rer1pは液胞への正方向輸送にもなんらかの影響を与えている可能性がある.

　さらに,Rer1pがSec12p,Sec71pのようなまったく正反対のトポロジーをとるものに対して共通の制限因子であるという可能性について検証した.もし,Sec12p,Sec71pが共通の因子によって認識されているならば,MS71HpだけでなくさらにSec71pそのものやSec12pの発現も同時に増加させることによって競争がおこり,結果としてMS71Hpから生じる成熟型接合因子量は増加すると予想される.Sec12pの細胞質領域はRer1p非依存的な静的残留,膜貫通領域はRer1p依存的な逆送シグナルを含むことが明らかとなった(Sato et al.,1996)ので,Sec12pのかわりにDap2pそのもの(DDD)と,膜貫通領域をSec12pのものと置換し完全に小胞体に局在化するようになったキメラ(DSD)を用いて解析を行った.その結果,MS71Hpを過剰発現している野生株に,さらにSec71pそのものやDSDを共発現したところ,1.7倍,1.9倍にまでMS71Hp依存的な成熟型接合因子の分泌が上昇し,ともにMS71Hpと競争的効果を示した(表1).一方,DDDはベクターコントロールとほとんど差違が見られなかった.また,rer1遺伝子破壊株では,この効果は消失した.以上のことから,Rer1pはSec12pとSec71pの両者を認識する制限因子の一つであると結論した.

　COPIはRothmanらによって動物細胞でゴルジ層板間輸送にはたらく輸送小胞上のコートタンパク質として同定された.近年,Letourncur,Cossonらの酵母を用いた研究によって,このCOPIの構成因子である-COP(Ret1p)などが,ゴルジ体から小胞体への逆送シグナルKKXXに結合すること,またそれらの変異株ではKKXXシグナルをもつタンパク質の局在に異常が見られることなどが明らかとなり,COPIが小胞体膜タンパク質のゴルジ体から小胞体への逆向き輸送に働く可能性が示唆されてきている.

　そこで,Rer1pとCOPIとの関連を調べるために,rer1遺伝子破壊株と温度感受性変異株ret1-1の二重変異株を構築したところ,ret1-1変異株に比べ制限温度の低下が見られた.一方で,ret1-1mf1mf2bar1という株を構築し,この株におけるS12Mp,MS71Hp,MS63pの挙動を調べた(図5).いずれの場合もret1-1変異株は,多コピープラスミド上の発現による成熟型接合因子のハローを大きくする効果を示した.特にMS63Lpに関しては,単コピープラスミド上で発現させたときでもハローを形成した.これらの結果から,KKXXシグナルのような既知のシグナルをもたない小胞体タンパク質の局在化にもCOPIが関与していることが初めて明らかとなった.また,逆送過程にRer1pとCOPIが協調して働く可能性が示唆された.