インセクトレーザー法によって採集されたイネ篩管液中に含まれるタンパク質のうち,最も存在量の多い,分子量約13kDaのタンパク質(RPP13-1)の内部アミノ酸配列(32残基)を元にして17塩基から成るオリゴヌクレオチドプローブを合成し,これを用いてイネの葉から作られたcDNAライブラリーをスクリーニングした.単離されたcDNAクローンの塩基配列の決定を行ったところ,このcDNAは全長687塩基対で,122アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた.データベースを用いて相同性検索を行った結果,cDNAの塩基配列から予想されるタンパク質はチオレドキシンhと高い相同性を示し,チオレドキシンとしての活性部位配列(-W-C-G-P-C-)を含んでいた.チオレドキシンはほとんど全ての生物細胞に存在する大きさ約10数kDaのタンパク質で,チオレドキシン還元酵素によって活性化され、チオール基還元活性を持つことが知られている.植物においては3種類のチオレドキシン(f,m,h)が存在するが,このうちチオレドキシンhは細胞質型である.このcDNAを大腸菌体内で大量発現させて作られたタンパク質はRPP13-1と分子量,等電点共に等しく,またジスルフィド結合の還元活性を有していた.さらに抗コムギチオレドキシンh抗血清に対してRPP13-1と同様に結合することから,RPP13-1がチオレドキシンhであることを同定した(以降,RPP13-1を篩管液チオレドキシンhと呼ぶ).篩管の生理状態を損なわない方法で得られた篩管液中のタンパク質の同定は,これが初めてである.篩管中でチオレドキシンは,酸化的傷害を受けたタシパク質の機能回復,酵素やレセプタータンパク質の活性調節,及び活性酸素の除去などに働いていることが予想される.

　篩管は核やリボソームを持たず,それ自身によるタンパク質の新規合成は不可能であると考えられるが,一方で篩管中のタンパク質は次々と更新されるとの報告がある.このため,一般に篩管液中のタンパク質は,伴細胞において合成され,原形質連絡を通じて篩管に送られる可能性が高い.従ってイネ篩管液中に多く存在するチオレドキシンhをコードする遺伝子は,伴細胞において強く発現していると推測される.cDNA配列を用いてin situハイブリダイゼーションを試みたところ,この遺伝子のmRNAはイネの葉,茎において維管束内部で多量に蓄積していた.原生導管を持つが後生導管はまだ発達していない若い維管束では篩部を含め維管束全体において蓄積が見られるが,後生導管の成熟した維管束では篩部,特に伴細胞で多量の蓄積が観察された.篩管液を採集している葉鞘の維管束は後者であることから,先の伴細胞で強く発現するという推測は正しいことが証明された.同時に,篩管液チオレドキシンhの遺伝子発現は分化の度合に従って調節されていることが示唆された.

　上でも述べたように,篩管液中のタンパク質は原形質連絡を通じて篩管に入る可能性が高い.しかしながら種々の大きさの蛍光物質を細胞内に注入して,その隣接細胞への拡散移動を観察する実験により,原形質連絡を通ることのできる分子の大きさには限界があることが知られている.現在までに知られているこの限界の最大値は,Vicia fabaの篩部要素-伴細胞間で報告されている10kDaであり,また通常の葉肉細胞間での限界は約1kDa程度である.にもかかわらず篩管液中にはこれよりも分子量の大きなタンパク質が多数存在することから,篩管液中のタンパク質は何らかの機構によって原形質連絡を拡げることで細胞間を移動できる,もしくは輸送されると考えられる.そこで,先に単離したイネ篩管液チオレドキシンhが原形質連絡の性質を変化させる能力を持つかどうかを調べる実験を行った.

　まず単離したcDNAを用いて大腸菌体内で作らせた篩管液チオレドキシンhをFITCにより蛍光標識した.これをタバコ葉の葉肉細胞内にマイクロインジェクションして蛍光の移動を観察することで,タンパク質の細胞間移動能を検定した.尚,タバコ葉肉細胞間では,原形質連絡を通過できる分子の大きさは約1kDa程度である.その結果,インジェクションした細胞からその近隣の細胞へと蛍光の移動することが観察された.また,それ自体はタバコの葉肉細胞間を移動することのできない約10kDaの蛍光標識されたデキストランと,蛍光標識していない篩管液チオレドキシンhとを混合したものをマイクロインジェクションしたところ,やはり蛍光が細胞間を移動することが観察された.これらの実験から,篩管液チオレドキシンhは,それ自体が細胞間を移動する能力を持つと共に,原形質連絡の物質透過性を上げる能力を有することがわかった.これとは別に,蛍光標識した大腸菌のチオレドキシンをマイクロインジェクションしたところ,蛍光の移動が見られなかった.以上の結果は,細胞間移動能はジスルフィド結合の還元活性とは関連がなく,タンパク質中の活性部位以外の部分にこれを決定する要素が存在することを予測させるものである.そこで,篩管液チオレドキシンhの部分変異体を複数作成し,これらをマイクロインジェクションすることで,変異の細胞間移動能に対する影響を調べた.この結果,篩管液チオレドキシンhのN末端にある5アミノ酸残基を欠損させた変異体と,C末端に近い親水性アミノ酸の集まっている領域にある4アミノ酸残基をアラニンに置換した変異体とにおいて,細胞間移動能が著しく損なわれていた.よって,こうした領域が細胞間移動に深く寄与していることが示唆された.

　イネ篩管液チオレドキシンhをコードするmRNAは成熟葉においては伴細胞で多量に蓄積することから,この遺伝子のプロモーターは葉においては伴細胞で活性化されていると考えられる.そこで,プロモーター領域を含むイネゲノムDNA断片の単離と,その活性の解析を試みた.cDNAを用いてイネゲノムDNAライブラリーをスクリーニングしたところ,約3000塩基対からなるゲノム断片を単離した.塩基配列を決定したところ,この断片は約1000塩基対の5’上流プロモーター領域と,2つのイントロンと3つのエキソンからなる篩管液チオレドキシンh遺伝子を含んでいた.プロモーター領域中には,スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子のプロモーターと相同性のある配列や,分裂組織で強く発現するポリペプチド鎖延長因子EF-1遺伝子プロモーターに共通な配列tef1が存在していた.このチオレドキシンh遺伝子プロモーター領域の活性の組織特異性を検定するため,レポーター遺伝子である大腸菌-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子と融合させ,これを導入した形質転換イネを作成した.形質転換体中でのGUS活性は維管束周辺,特に篩部において観察された.この発現パターンは先にin situハイブリダイゼーションによって調べられたmRNAの蓄積パターンと同様であった.よって成熟葉においては,このプロモーター領域が伴細胞での組織特異的な発現に十分であることが示された.

　以上の結果から,イネ篩管液中に多量に存在する可溶性タンパク質の一つとして,ジスルフィド結合還元活性を持つチオレドキシンhが含まれていることが明らかとなった.この篩管液チオレドキシンhをコードする遺伝子は,篩管液を採取している葉鞘においては伴細胞で強く発現しており,さらに篩管液チオレドキシンhは原形質連絡を移動する能力を持つことが示された.これらの結果は,従来考えられていた,篩管中のタンパク質は伴細胞で合成されて原形質連絡を通じて篩管に入る,とする仮説を強く支持するものである.