39種類の癌細胞株から培養上清を得、PC12細胞に対して突起伸長を示すものをスクリーニングした結果、6種類に活性が検出された。このうちマウス肝細胞株MLE-15A2の培養上清中の活性についてMDDF(MLE-15A2 cells-derived differentiation factor)と命名し、その性質の検討を行った。この活性はプロテアーゼ、DTT,高温処理によって失活したため、タンパク性であることが予想され、ゲル濾過による推定分子量は80kDaであった。この活性の部分精製標品を用いてシグナルの解析を行った。PC12細胞を刺激後、細胞内タンパクのチロシンリン酸化を抗リン酸化チロシン抗体を用いたwestern blottingによって調べた。NGF刺激の際とは異なり、ほとんどリン酸化は見られなかった。さらに、MDDF刺激後のMAP Kinaseの活性を測定したところ、5分後にごく弱い活性が見られるに過ぎず、NGFの場合とは全く異なることが示された。さらに、MDDFによる突起伸長にMAP kinaseの活性化が必要であるかどうかをMAP kinase kinaseの阻害剤である PD98059を用いて調べたところ、必要でないことが明らかとなった。また、PI-3 kinaseの阻害剤であるwortmanninによっても突起伸長は阻害されず、MDDFによる突起伸長にはPI-3 kinaseも必要でないことが示された。以上のことから、MDDFはNGFとは全く異なるシグナル伝達を介してPC12細胞に突起伸長を誘導する新しいタイプの因子であることが示唆された。

　先に述べたように、NGFによるPC12細胞の突起伸長の過程は複数の段階から成ると考えられる。そこで、突起伸長の誘導を開始する初期段階ではNGFの刺激を必要とするが、その後のステップではNGFを代替できるような因子のスクリーニングを試みた。癌細胞培養上清から、通常のPC12細胞に対しては何ら活性を持たないが、あらかじめNGF存在下で2時間培養した(以下initiationと記す。)細胞に対しては突起伸長活性をもつものをスクリーニングした結果、ヒトglioblastoma由来細胞株SF295培養上清中にその様な活性が検出された。そこでこの活性の精製をおこなった。培養上清を出発点とし、CM TOYOPEARL,Blue TOYOPEARL,Syncropak CM,逆相カラムによる精製を経て、逆相カラムの溶出フラクションをSDS-PAGEにより分離したところ、24kDa付近に活性と対応する単一のバンドが検出された。このバンドをゲルから切り出し、リジルエンドペプチダーゼで切断して得られた2断片についてアミノ酸配列を決定したところ、このタンパクはIL-6(Interleukin-6)と同定された。市販の組換え体IL-6を用いても目的とする活性が検出されたため、活性の本体はIL-6であることが確認された。

　IL-6は免疫系、造血細胞などにおいて多様な機能をもつサイトカインであるが、神経系での役割も示唆されてきている。PC12細胞に対しては単独で突起伸長を誘導するとの報告が以前なされたが、その後否定される報告も出ており、われわれの結果とも一致しない。いずれにしても今回明らかになったNGF initiation後の細胞に対する突起伸長活性はIL-6の持つ活性として新しいものである。そこで、このIL-6の活性に必要なシグナルの解析を行った。

　IL-6レセプターはリガンドと結合するIL-6レセプター鎖と、細胞内にシグナルを伝えるのに必要なgp130からなる。IL-6の刺激によってgp130はチロシンリン酸化をうけ、このリン酸化チロシンに対して様々な分子が会合することによってシグナルが伝わることが知られている。現在までに明らかになっている経路は、Ras-MAPkinase経路とSTAT3を介する経路であり、この両者を活性化するのに必要なgp130のチロシンリン酸化部位も明らかになっている。そこで、G-CSFレセプターの細胞外ドメインとgp130の細胞内ドメインに様々な変異を加えたものから成るキメラレセプターをもちいて、IL6による突起伸長にはどの経路が必要であるかを検討した。キメラレセプターの発現ベクターをPC12細胞にmicroinjectionし、NGFでinitiationしたのちG-CSFで剌激し、突起の伸長を観察した。Wild typeのレセプターを発現させた場合にはIL-6で刺激したときと同様な突起伸長がみられたため、この系は有効であることが示された。一方、MAP kinase経路に必要なチロシンリン酸化部位をフェニルアラニンに置換した変異レセプターを発現させた場合には、突起の伸長は阻害された。NGF initiationののちにIL-6で刺激する系においてもIL-6刺激と同時に細胞にMAP kinase kinaseの阻害剤であるPD98059を加えるとやはり突起の伸長が阻害されることから、IL-6の突起伸長にはMAP kinaseの活性化が必要であることが示唆された。

　一方、STAT3を活性化することで知られているチロシンリン酸化部位をフェニルアラニンに置換した変異レセプターを発現させた場合には突起伸長には影響せず、むしろ活性が強くなっているかのように観察された。そこで、この変異レセプターを発現させた細胞の突起伸長にはNGFによるinitiationは必要でないかもしれないと考え、G-CSFでのみ刺激した結果、NGF initiation後と同様な突起の伸長が観察された。このことから、STAT3はIL-6単独による突起伸長に抑制的に働いている可能性が考えられる。そこで、wild typeのレセプターとともにdominant negative STAT3をinjectionしたところ、やはりinitiationなしで突起伸長が観察された。以上のことから,STAT3は突起伸長に抑制的に働くものと考えられる。最後にNGFのSTAT3の活性に与える影響について調べた。細胞をNGFでinitiationした場合としない場合についてIL-6によるSTAT3の活性化を、STAT3による免疫沈降ののち抗リン酸化チロシン抗体でwestern blottingを行うことによって調べた。その結果、NGFでinitiationした場合にはしない場合に比較してチロシンリン酸化のレベルが著しく減少していることが明らかになった。以上のことから、NGFinitiationの意義は突起伸長に抑制的にはたらくSTAT3の活性化を抑える点にあるのではないかと考えられる。

　単独で突起伸長活性を持つMDDFに関してはその活性にNGFの場合に必要とされているシグナルは必要でないことが示され、この因子によるシグナル伝達を解析することで突起伸長に必要な新たなシグナルを見い出す可能性が示された。

　また、NGF initiation後の細胞に突起伸長を誘導する因子を検索した結果、IL-6を同定できた。そのシグナル伝達を解析した結果、STAT3が突起伸長後に抑制的な役割をはたしていること、およびNGFの刺激がSTAT3活性化を抑制することが明らかになった。STAT3はPC12細胞を分化でなく増殖に導くEGFによって活性化され、逆に分化を促すNGFでは抑制される。このことから増殖と分化という細胞の命運を左右する段階でSTAT3が重要な役割を果たしていることが考えられた。