Pseudomonas aeruginosaのNirはヘム型のcytochrome cd1であるが、本酵素のin vivoにおけるプロセッシングの機構、特に本酵素にのみその存在が確認されているheme d1の合成機構に関しては、不明な点が多く残されている。脱窒遺伝子クラスター内には、脱窒反応に特異的に関与する遺伝子群がクラスターをなして存在しており、過去において酵素反応を指標とした解析実験では得ることの難しいコンポーネント蛋白質をコードするいくつかの遺伝子を同定した経緯もあり、更なる解析によるheme d1合成領域の同定が期待された。Pseudomonas stutzeriでは、脱窒クラスター内のNirの構造遺伝子nirS下流域におけるトランスポゾン変異株から、いくつかのheme d1 deletion mutantが得られており、nirS下流域にheme d1合成領域の存在が推定されていた。また、nirS遺伝子を脱窒能を有さない他菌種へ導入すると、heme d1を欠如したsemi-apoNirが発現することなども、脱窒菌特有のheme d1合成領域の存在を示唆している。本研究では以上の知見を踏まえ、それまでに報告がなかったnirS下流域の構造解析を行うことによる新規遺伝子領域の発見と、亜硝酸還元反応に関与する遺伝子領域の解明を試みた。その結果、nirSMC下流域に新たに8個のORFを発見し、遺伝子構造の解析の結果、合計11個の遺伝子群(nirSMCFDLGHJEN)が、nirS上流のプロモーターに制御される約9kbのオペロン単位として存在していた。

　本章では、nirオペロン構成遺伝子群の機能解明を試みた。データベースを利用したホモロジー解析や、遺伝子産物上の保存配列からの知見を得た結果、第一章で発見した新規な遺伝子8個のうち7遺伝子が機能不明な蛋白質をコードしていた。また、ヘム合成のキーエンザイムであるUroporphyrinogen III methyltransferaseをコードすると推定される遺伝子(nirE)が存在したことから、新規領域のheme d1合成への関与が示された。そこで新規遺伝子の機能性追求の手段として必要となるNir蛋白質、及びheme d1の精製を行った。その後、新規遺伝子の欠損株をMarker exchange mutagenesisの手法で作成し、得られたミュータントの性質を、WesternによるNir蛋白の発現と、heme d1および欠損遺伝子による相補実験を行うことで解析した。その結果、本オペロンは、Nitrite reductaseの構造遺伝子nirS、亜硝酸還元に関与するチトクロム蛋自質をコードすると推定されるnirMCとnirN遺伝子、およびheme d1の生合成に必要不可欠なnirFDLGHJE遺伝子で構成されていた。

　脱窒反応は嫌気条件下で起こる反応として古くから知られていたが、詳細な発現のメカニズムに関しては明らかとなっていない。P.aeruginosaの脱窒反応は、酸化還元レベルを認識する転写調節因子ANRの欠損株では発現しないことが、Hassらの実験により明らかになっている。また脱窒遺伝子クラスター内に存在し、新規転写調節因子をコードすると推定されるdnr遺伝子も、脱窒遺伝子の発現へ関与することが新井らのプロモーター活性を指標とした実験により推定されている。本章では、これら転写調節因子の脱窒反応への関与を明らかにすることを目的として、脱窒反応のキーエンザイムであるNirの発現を指標として実験を行った。本実験にはanr欠損株PAO6261株、dnr欠損株RM536株を用い、(1)両転写調節因子の発現への関与(2)Nir発現と酸素濃度との相関関係(3)ANR,DNR両転写調節因子の認識機構、について検討を行った。その結果、PAO6261,RM536株でNir蛋白の発現は誘導されず、両遺伝子のNir発現への必要性が明らかとなった。またPAO6261株にdnr遺伝子を強制発現させた結果、Nirの発現が誘導されたことから、ANR→DNR→Nirのカスケード式調節機構で制御されることが推定された。酸素濃度レベルによるNir発現の影響を観察したところ、野生株では酸素濃度5%以上でNirの発現が観察されなかった。ANRは酸素濃度を酸化還元レベルの変化として認識する転写調節因子であるので、ANRによる嫌気制御を解除することで、好気環境下におけるNir発現を制御できるのではないかと考え、PAO6261株においてDNRを強制発現させた株におけるNirの発現と酸素濃度の相関性を観察した。その結果、野生株とほぼ同様の結果が得られ、DNRによる転写調節が、ANRと同様、酸素濃度レベルに影響されることが明らかとなった。DNRはANRに保存される酸化還元レベルの認識に関与するシステインクラスターを有しておらず、新規の酸化還元レベルの認識機構を有することが推察された。そこでDNRが亜硝酸の有無を感知する可能性が考えられたため、DNRを強制発現させた株において、低酸素濃度下での亜硝酸濃度とNir発現との相関性を観察したところ、亜硝酸非存在下ではNir発現が誘導されず、DNRが亜硝酸の存在を認識する転写調節因子であることが示された。

　P.aeruginosaの脱窒遺伝子クラスターを解析した結果、nirSMC下流に新たに8個の遺伝子を発見し、nirSの上流のプロモーターから供転写される約9kbのオペロン構造を形成していた。nirオペロンの機能性解明を、欠損株の作成と相補実験の解析により試みた結果、亜硝酸還元反応を触媒すると推定されるチトクロム蛋白質をコードする遺伝子や、Nirのcofactorであるheme d1の生合成に必要不可欠な蛋白質をコードする遺伝子など、亜硝酸還元反応に直接関与する遺伝子群で構成されていた。

　脱窒反応の発現を、Nir蛋白質の発現を指標として解析を行った結果、酸素濃度レベルを認識するANRと亜硝酸の存在を認識するDNR両転写調節因子によってANR→DNR→Nirというカスケード式に発現制御されていることが示された。

　今後は、本遺伝子クラスターを他菌種で発現させる試みなどを通じて、未だ機能性の不明である遺伝子群の役割や、脱窒反応全体の詳細な発現制御機構の解明が望まれる。また本研究により得られた知見は、今後の脱窒反応の人為制御への応用に役立つことが期待される。

図表