近年、分子生物学的手法を用いて、シナプスでの神経伝達物質開口放出に関する研究が急速に進んでいる。神経終末でのシナプス小胞のみならず、種々の小胞輸送経路に於いて、Rothmanは、SNARE仮説といわれる小胞融合の仮説を提唱した。多くの場合、小胞と、その標的となる膜との融合には、NSF(N-ethylmaleimide-sensitive factor)と呼ばれる、ATPaseが必要である。NSFの膜への結合には、膜表在性のSNAP(soluble NSF attachment protein)という因子が必要で、小胞とその標的膜には、それぞれ、v-SNARE(vesicle-SNAP receptor)、t-SNARE(target-SNAP receptor)という、膜に埋め込まれたSNAP受容体が存在する。小胞が正しいオルガネラとドッキングするという特異性は、SNAREファミリーの結合の特異性による、というものである。神経終末におけるシナプス小胞と細胞膜との融合にも、NSF-SNAP複合体が必要であり、ここでは、v-SNAREに相当するものがsynaptobrevin/VAMP、t-SNAREに相当するものがシンタキシンとSNAP-25(synaptosomal protein 25kD)であると考えられている。

　神経終末においてシナプス小胞の開口放出は、プレシナプス膜上のactive zoneといわれる部分でのみ行われるので、新たに神経伝達物質をとりこんだシナプス小胞は、まずこのactive zoneへと移行し、膜とドッキングしていなければならない。(docking)この過程には、Rab3AとRabphilin-3Aが関与していると考えられている。ここでシナプス小胞は、カルシウムの流入があったときに、すぐに膜と融合できるような状態へと変化する。(priming)このprimingはATP依存的で、NSF-SNAP-SNARE複合体が必要である。Munc-18は、以下に述べるように、このdockingとprimingの過程に関与していると考えられている。

　Munc-18は、1993年、T.C.Sudhofらによって、シンタキシン結合蛋白質としてラットからクローニングされた。Munc-18は、線虫のunc-18、ショウジョウバエのrop、また酵母のsec-1遺伝子の哺乳類ホモログである。線虫のunc-18の変異は、全身がしびれているといった表現形を示し、ショウジョウバエのropの変異は、分泌欠陥を示す。またショウジョウバエでの、ropの過剰発現は、神経終末でのシナプス小胞の蓄積をもたらす。生化学的には、Munc-18蛋白質はシンタキシンと強く結合する。t-SNAREであるシンタキシンは、同じくt-SNAREであるSNAP-25、v-SNAREであるsynaptobrevin/VAMPと1:1:1の割合で、SDS resistantな、core complexといわれる複合体を形成するが、MUNC-18と結合したシンタキシンは、SNAP-25と結合することができない。従って、Munc-18は、シンタキシンと結合することによって、シナプス小胞の開口放出に対しては抑制的に制御していることが予想され、また、unc-18やropの変異体の表現形とRab3Aノックアウトマウスの類似性から、小胞のactive zoneへのtargetingとの関与も考えられている。t-SNAREであるシンタキシン、SNAP-25とv-SNAREであるsynaptobrevin/VAMPからなるcore complexの結合は非常に強いが、実際in vivoでは、シンタキシンはある程度MUNC-18と結合しており、synaptobrevin/VAMPは大部分synaptophysinと結合している。Munc-18、Synaptophysinの機能は、両者がなければ会合してしまうcore complexの相互作用を阻害し、適切な量のシナプス小胞がactive zoneへ移行するよう、制御することにあるのかもしれない。

　我々の研究室でもこのMunc-18 cDNAを独自に単離し、その遺伝子の構造と機能の解析を行っている。

　Munc-18のマウス各組織における、また発生過程における発現の変化をみた。ノーザンプロット解析の結果、マウスにおいても脳特異的に発現がみられ、そのmRNAサイズは、約3.7Kbであった。発生過程においては、生後もその発現が増大しているが、2〜3週齢あたりからは、ほぼよこばいである。Munc-18の神経終末におけるその機能から考えて、脳のニューロンネットワークの成熟と関係しているのかもしれない。

　マウスのgenomic libraryをスクリーニングし、Munc-18ゲノムの構造を明らかにした。S1 mappingにより転写開始点を、3’RACEによりpolyadenylation siteを決定したところ、マウスMunc-18遺伝子の構造は、ゲノムサイズが40Kb以上にわたること、19のエキソンから成ることが明かとなった。プロモーター領域はGC-richでTATA-lessであった。

　CAT(chloramphenicol acetyltransferase)遺伝子をreporter geneとし、PC12D細胞をモデル系としてMunc-18遺伝子の転写を制御している領域を決定した。PC12D(ラット由来)はendogenousなMunc-18を発現しており、L-cell(マウス由来)はMunc-18の発現がみられないことは確認している。また、PC12Dは、NGFの添加によって神経細胞様に分化することが知られているが、Munc-18の発現自体はNGFの添加によっては、ほとんど変化しない(多く見積もっても1.5倍程度)ので、trnasfection、CAT assayは全て分化前の細胞で行った。プロモーター活性は予想していたよりもPC12DとL-cellで差がなかったが、2〜3倍程度の差はみられ、またコンストラクトを削っていくにしたがって活性の減少もみられた。

図表

　ゲルシフトassayにより、転写調節蛋白質の有無を検討した。しかしbinding proteinの有無は、PC12Dとbrainで多少違う結果となった。あるproteinは、brain、liver、L-cellの核抽出液にはあるが、PC12Dには少ないようである。また、あるproteinはbrain specificかとも思われたが、PC12D、L-cellの核抽出液にもあるようだ。

　Munc-18は3つのサブタイプが報告されているが、脳で発現しているのは、本研究のMunc-18aだけである。Munc-18は脳で強い発現がみられるが、副腎髄質や、膵臓のendocrine cellでも発現があると報告されている。これは、Munc-18ばかりではなく、SNAP-25やsyntaxin、VAMPなどもそうである。これらの小胞融合に関与する蛋白質は、脳での神経伝達物質の開口放出ばかりでなく、副腎髄質や、膵臓でのホルモン分泌にも重要な役割を果たしていると思われる。

　PC12Dは副腎髄質由来の細胞であるので、Munc-18のプロモーター活性をPC12Dでみれば、脳の転写調節を反映しているとは限らないが、副腎髄質での発現はかなり正確にみられると思われる。従って、ここではPC12Dで、脳ではなく副腎髄質でのプロモーター活性を調べており、脳と副腎髄質との間の転写調節の違い、あるいは共通部分がゲルシフトアッセイで検出できると考えられる。

　以上から、Munc-18遺伝子について、そのゲノムの構造が明かとなり、PC12Dにおいて、その転写調節に必須のDNA elementを同定したといえる。