T.reeseiのセルラーゼ系ではBGL活性が低く、セルロース糖化の際、多量のセロビオースが残るといわれている。一方、Humicola属のセルラーゼ系ではBGL活性が高いとの報告があり、T.reeseiのセルラーゼ系を相補する候補として挙げられている。そこでBGLを中心にH.griseaのセルラーゼ成分を精製し、それらの諸性質を検討した。硫安分画、各種クロマトグラフィーなどの組み合わせによってH.griseaの培養抽出物よりEGLp1〜2、EXOp1、BGL1〜6の計9種の酵素を精製した。各酵素の至適温度は50℃から70℃の間に存在しており、至適pHは5から7の間に存在していた。精製酵素のうち、BGL1はp-ニトロフェニル--D-グルコシドに対する活性が高いアリル--グルコシダーゼであり、-キシロシダーゼ活性も有していた。BGL2,3,6はセロオリゴ糖に対し広い基質特異性を有していた。BGL4はラクトースなども分解する-ガラクトシダーゼ活性をもつ酵素であった。BGL5は長鎖型セロオリゴ糖に対し高い活性を示した。精製したEXOp1は他のセルラーゼ成分との相乗作用を失ったためか結晶性セルロースに対しては弱い活性しか示さなかった。EGLp1,p2はカルボキシメチルセルロースに対して高い活性を示したが、キシラン等に対しては活性がなかった。解析の結果からBGL4と5がセロオリゴ糖分解に大きく関わっていることが示唆された。本研究によりH.griseaが-グルコシダーゼ活性を持つ多数の酵素を生産していることが明らかとなった。

　精製酵素のアミノ酸配列に関する情報や他の糸状菌のセルラーゼ遺伝子とのホモロジーを利用して、bgl4遺伝子、EXOp1とは異なるEXO酵素をコードするexo遺伝子、EXOの一種であるセロビオハイドロラーゼ(CBH)の遺伝子、EGLp1,p2とはいずれも異なる酵素をコードする4種類のegl遺伝子、キシラナーゼをコードしていると思われる遺伝子をH.griseaの染色体上の独立した位置よりそれぞれクローン化し、その塩基配列の決定を行った。これらの遺伝子は近縁のH.insolensのセルラーゼ遺伝子と非常に高い相同性を示すものが多く、H.griseaとH.insolensのセルラーゼ系には共通点が多いことが示唆された。また、T.reeseiからもすでに報告されているセルラーゼ遺伝子の塩基配列などを利用して、2種のbgl遺伝子、2種のcbh遺伝子、3種のegl遺伝子をクローン化した。これらクローン化したセルラーゼ遺伝子をAspergillus oryzae由来のタカアミラーゼプロモーター下流に連結し、マルトースで誘導をかけA.oryzaeでの大量発現を行った。A.oryzaeで発現させたセルラーゼはnativeな酵素とは異なる糖鎖付加様式を示すことが示唆されたが、いずれの場合も活性は保持していた。酵素学的な解析を行ったところ、H.griseaのセルラーゼでは至適温度は55℃以上にあり、EGLの中には高温の熱処理に対しても安定な耐熱性酵素もあった。また至適pHは5付近にあるものが多かったが、中性〜アルカリ性領域でも活性を保持しているものもあり、T.reeseiのセルラーゼより高い温度条件や広いpH領域で活性を示すことがH.griseaのセルラーゼ系の特徴であると考えられた。一方、H.griseaとT.reeseiのセルラーゼ系を比較すると、T.reeseiの酵素では各基質に対する比活性がH.griseaのそれよりも高いものがあり、T.reeseiが効率のよいセルラーゼ系を構成しているものと思われた。

　糸状菌のセルラーゼでは触媒ドメイン、セルロース結合ドメイン(CBD)、およびこれらをつなぐhinge領域により構成されているものが少なくない。H.griseaのCBHは上述のような構造をとるものの、CBHと57.7%の相同性を示すEXOにはCBDやhinge領域は存在しない。そこでCBH、EXOに関して、部位特異的変異導入法などを用いてお互いの各ドメイン間で組み換えを可能にし、これによって生じるキメラ酵素をA.oryzaeで大量発現させ、その諸性質を検討した(図1)。CBDのないEXOやCExは、至適温度が、CBDのあるCBHやExCにくらべて5℃高かったことから、CBDが各酵素の温度特性に影響を与えている可能性が示唆された。結晶性基質であるAvicelに対する活性ではCExの活性がCBHよりも減少したことから、CBHによる効率のよい結晶性基質の分解に関しては、CBDが必要なものと思われた。一方、ExCではAvicel分解に関してCBD付加による顕著な効果は認められず、また可溶性基質であるカルボキシメチルセルロースに対する活性もEXOにくらべ激減するなどの結果から、EXOにはCBDは必ずしも必要でないと思われた。しかし、他のセルラーゼと組み合わせてAvicel分解を行った場合では、ExCがEXOよりも高い相乗効果を示したことは興味深い。

図1CBHとEXO、およびそれらのキメラ酵素

　つぎにH.griseaのBGL4とこれと73%の相同性を示すT.reeseiのBGL2の成熟酵素のN末端およびC末端領域約70残基をお互いの酵素間で組み換えたキメラ酵素を作製し、A.oryzaeで発現させ、その諸性質を検討した。なお、N末端側の組み換えでは11残基、C末端側の組み換えでは15残基がnativeな酵素とは異なるアミノ酸残基をもつことになる。N末端領域を交換した場合、H.griseaのBGL4の至適温度は55℃から50℃に減少したが、T.reeseiのBGL2では40℃のままだった。また組み換えにより活性がnativeな酵素にくらべ上昇したものや減少したものがあったことから、N末端およびC末端領域が活性発現に影響を与えていることが示唆された。

　また糸状菌のCBD間ではよく保存されているアミノ酸残基が存在することが知られているが、このうちTyrやTrpといった芳香属系のアミノ酸残基が疎水平面を形成し、この疎水平面とセルロースとの相互作用で、セルロースに結合することが知られている。そこでこれらのアミノ酸残基に変異を導入したH.griseaのCBHを作製し、セルロースへの結合に及ぼす影響を解析中である。

　Aspergillus属の糸状菌からカタボライト抑制にかかわるzinc fingerタンパク質をコードするcreA遺伝子が単離されている。そこでA.nigerのcreA遺伝子をプローブとしてT.reeseiからcreA(crel)遺伝子をクローン化した。さらにT.reeseiのcreA(crel)遺伝子をプローブとしてH.griseaからもcreA遺伝子をクローン化した。T.reeseiのセルラーゼ系はカタボライト抑制をうけることが知られているが、H.griseaのセルラーゼ系に関しては知見が得られていないので、ノーザン解析を行ったところ、グルコース存在下でセルラーゼ遺伝子の発現が抑制され、かつこの条件下でcreA遺伝子が強く発現していることが確認できた。つぎにT.reeseiおよびH.griseaのCREA(CRE1)タンパク質のzinc finger領域と大腸菌マルトース結合タンパク質との融合タンパク質を作製し、これらを用いて、セルラーゼ遺伝子のプロモーター領域とのbinding assayを行った。ゲルシフト法およびDNaseI footprintingによる解析の結果、Aspergillus属のCREAが結合するSYGGRG様配列に融合タンパク質が結合していることがわかり、T.reeseiおよびH.griseaのCREA(CRE1)がセルラーゼ遺伝子のカタボライト抑制に関与していることが強く示唆された。

　本研究によりH.griseaおよびT.reeseiのセルラーゼ系を構成する様々な酵素の諸性質や遺伝子構造を明らかにした。両菌株のセルラーゼ遺伝子の大量発現系の確立とタンパク質工学による酵素の改変の成果、ならびにセルラーゼ遺伝子の発現制御に関する本論文の知見は、菌株の改良等による強力なセルラーゼ系を構築する上で大いに役立つと考えられる。