先に述べたように分裂酵母に対してTSA処理を行っても増殖の阻害が見られなかった。このことは、薬剤の透過性が悪いことに加えて動物細胞に比べて分裂酵母のヒストン脱アセチル化酵素のTSA感受性が低いことに起因している可能性が強く示唆される。そこで変異処理により感受性が上昇すれば、増殖阻害が観察でき、さらにこの感受性を相補する遺伝子をクローニングする事によりヒストンアセチル化酵素及びその制御因子を取得することができると考えた。野生株S.pombeをEMS変異処理し、26.5℃でTSA感受性を示す変異株をスクリーニングした。その結果、約1×10⁸の頻度で許容温度下で目的の形質を有する変異株を1株(tss1)取得した。tss1株はTSA5g/mlという野生株の10分の1以下の濃度で増殖が阻害された。この変異株は調べた限り他の薬剤との交差感受性は見られなかったが、唯一、もう一つのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトラポキシンに感受性を示した。従って、この変異株に生じた変異はヒストン脱アセチル化酵素そのもの、あるいはヒストンアセチル化制御に関与する遺伝子の変異である可能性が高いと考えられた。また、各種ストレスに対する感受性を調べたところ、イオンストレスに対する感受性が上昇していた。tss1株の変異の優劣を決定するため、減数分裂不能変異株との接合によって安定な二倍体をつくりdominance testを行った。その結果、TSA感受性は劣性であることが明らかとなった。四分子解析を行ったところ、tss1株の変異が1つではなく、致死性を与える変異とその致死性を相補する変異の二重変異であり、これら2つの変異が共存してTSA感受性を示すことが明らかとなった。従って本変異株において原因変異遺伝子の特定という点においては困難であるが、TSA耐性賦与という指標に基づくヒストンアセチル化制御因子のクローニングには問題ないと考え、tss1株を以後の遺伝子クローニングの受容菌株として用いることにした。

　tss1株のTSA感受性が劣性であったことから、TSA耐性の賦与を指標に、S.pombe野生株の染色体DNAより作成したゲノムライブラリーを用いてtss1株を形質転換し、TSAに対する耐性を野生株並にまで上昇した形質転換体を計6株取得した。各々からプラスミドの単離を試みたところ、4株のプラスミド(pTSR2,pTSR5,pTSR13,pTSR32)は回収できたが、残る2株(TSR4,TSR11)の回収ができなかった。そこで、各株をcuringし、得られた形質がプラスミド由来であるかを確認したところ、TSR4株を除いて全ての株がプラスミド由来であることが判明した。従ってTSR4株はプラスミドが宿主染色体DNAに挿入されたこと、TSR11株は何らかの理由により酵母細胞内でプラスミドの部分的欠落が起こり大腸菌のoriを失ったことが判明した。回収できたプラスミドの制限酵素地図を比較したところ、3種(pTSR2,pTSR5,pTSR13)がオーバーラップしていた。

　3種のプラスミドでオーバーラップしていたtsr1を含むプラスミドpTSR5について必須領域のサブクローニングと塩基配列の決定を行った。その結果、tsr1は497アミノ酸残基からなる新規の蛋白質をコードしていることがわかった。ホモロジー検索を行ったところ、特に高い相同性を持つ蛋白質は存在せず、機能の推定はできなかった。本遺伝子を多コピーで導入されたS.pombe感受性株tss1は、TSAとトラポキシン以外の他の薬剤に対して感受性が変化しなかった。現在、遺伝子破壊株の構築などの遺伝学的解析と、遺伝子産物に対する生化学的解析を行っているところである。

　tsr2遺伝子を含むプラスミドpTSR32について必須領域をサブクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、tsr2は3つのイントロンを有する4つのエクソンに別れており、322アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわかった。ホモロジー検索の結果、本遺伝子産物は、分裂酵母の細胞周期のM期進行に関与しているdis2遺伝子の変異株のサプレッサーとして京都大学理学部の柳田らによりS.pombeからクローン化されたタイプ1フォスファターゼsds21⁺と完全に一致した。本遺伝子は、柳田らの研究により必須遺伝子ではないこと、dis2遺伝子産物とともに細胞周期のM期進行に関与しているらしいことが明らかとなっている。

　1996年に入り、アメリカのS.Schreiberらによりトラポキシン結合蛋白質としてヒトからヒストン脱アセチル化酵素遺伝子Hd1がクローン化された。この遺伝子は、出芽酵母の転写制御因子であるRPD3と相同性があり、RPD3遺伝子産物にヒストン脱アセチル化酵素活性があることが示された。そこで、分裂酵母におけるRPD3ホモログ遺伝子をクローン化を行った。HD1とRPD3間で高く保存されている領域を利用してランダムプライマーを作製し、分裂酵母のゲノムを鋳型としてPCRを行い、単一のバンドを取得した。このDNAをプローブとして定法に従いRPD3ホモログ遺伝子全長を取得し、塩基配列を決定した。本遺伝子は434アミノ酸からなる蛋白質をコードしており、HD1と58%の相同性、76%の類似性を示した。この遺伝子をマルチコピープラスミドでtss1株に導入したところ、約4倍のTSA耐性を賦与した。本遺伝子の破壊株は、TSAに対して感受性を示さなかったが、DNA合成阻害剤ハイドロキシウレア及び各種イオンストレスに対する感受性が上昇し、また接合及び胞子形成能が欠損していた。

　3種のプラスミドでオーバーラップしていた必須領域の塩基配列を決定したところ、497アミノ酸残基からなる新規の蛋白質(tsr1)をコードしていることが明らかとなった。ホモロジー検索の結果、特に高い相同性を持つ蛋白質は存在せず、機能の推定は出来なかった。本遺伝子を多コピーで導入されたTSS1株はTSAとトラポキシン以外の薬剤に対して感受性が変化しなかった。このことから、本遺伝子産物がヒストンアセチル化制御因子のひとつであると考えられる。

　tsr2伝子を含む遺伝子の必須領域をサプクローニングし塩基配列を決定した。その結果、tsr2は3つのイントロンを有している322アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが明らかとなった。ホモロジー検索の結果、本遺伝子産物は分裂酵母の細胞周期のM期進行に関与しているdis2遺伝子の低温感受性変異株のサプレッサーとして京都大学理学部の柳田らによりS.pombeからクローン化されたタイプ1フォスファターゼsds21⁺と完全に一致した。本遺伝子は、柳田らの研究により、必須遺伝子ではないこと、dis2遺伝子産物とともに細胞周期のM期進行に関与しているらしいことが明らかとなっている。

　1996年に入り、アメリカのS.Schreiberらによりトラポキシン結合蛋白質としてヒトからヒストン脱アセチル化酵素遺伝子Hd1がクローン化された。この遺伝子は出芽酵母の転写制御因子であるRPD3と相同性があり、RPD3遺伝子産物にヒストン脱アセチル化酵素活性があることが示された。そこで、分裂酵母におけるRPD3ホモログ遺伝子のクローン化を行い、RPD3ホモログ遺伝子全長の取得、塩基配列の決定を行った。本遺伝子は434アミノ酸からなる蛋白質をコードしており、HD1と58%の相同性、76%の類似性を示した。この遺伝子を多コピーでTSA感受性TSS1に導入したところ、約4倍のTSA耐性を賦与した。本遺伝子の破壊株は、TSAに対して感受性を示さなかったが、各種イオンストレスに対する感受性が上昇し、また接合及び胞子形成能が欠損していた。このことから、本遺伝子は分裂酵母におけるヒストン脱アセチル化酵素である可能性が高いと考えられる。

　以上本研究は、分裂酵母のTSA感受性変異株を利用してヒストンアセチル化制御因子を取得し、分裂酵母におけるヒストン脱アセチル化に関わる制御に新しい知見をもたらしたとともに、今回取得された遺伝子産物の機能解析の研究を通じて、分裂酵母におけるヒストンのアセチル化/脱アセチル化を介した遺伝子発現制御機構を解明する一歩となるものである。

　よって、審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。