第2章ではヒポキサンチン-キサンチンオキシダーゼ(HX-XOD)系により細胞外に発生させたスーパーオキサイドラジカル(O2^-)に暴露したHV16-4、PC12およびC6細胞について、細胞内遊離カルシウムイオン濃度(Ca²⁺i)、脂質過酸化物、細胞内エネルギー代謝産物(ATP、ADPおよびAMP)、および細胞死に対するCa²⁺拮抗薬の効果を検討した。

　Ca²⁺iの変化はfluo-3をCa²⁺蛍光指示薬として、共焦点レーザー顕微鏡により細胞毎に経時的に観察した。すべての細胞において、XOD添加後100分までにCa²⁺iは増加し始め、さらに約10分後fluo-3の蛍光は急激に低下し、細胞死の指標として同時に負荷したヨウ化プロピジウム(Pl)の蛍光が増加した。このPl蛍光の増加した時間を細胞死の時間とし、これより平均生存時間を算出したところ、58.9±22.6(HV16-4)、62.8±19.0(PC12)、および50.2±13.4(C6)分であった。また、非特異的Ca²⁺拮抗薬であるコバルトイオン(Co²⁺)はすべての細胞において、Ca²⁺iの増加と細胞死を遅延させた。さらに、Ca²⁺の透過性を増加させるカルシウムイオノフォアA23187は細胞外フリーラジカル暴露と同様にCa²⁺iの増加とそれに続く細胞死を引き起こした。以上のことから、Ca²⁺iの増加が細胞外フリーラジカル暴露によるHV16-4、PC12およびC6細胞の細胞死に重要な役割を果たしていると考えられた。

　走査型電子顕微鏡による形態学的検索では、XOD添加後15分でHV16-4細胞上にブレブが観察され、その後ブレブは次第に大きくなり、破裂する像が観察された。PC12およびC6細胞においてもXOD添加後60分でブレブが観察された。一方、チオバルビツール酸反応性物質(TBARS)として測定した脂質過酸化物はHV16-4およびC6細胞においてはXOD添加後15分で増加したが、PC12細胞では変化が認められなかった。これらの結果から、ブレブ形成あるいはTBARSの増加として観察される細胞膜の傷害がCa²⁺の恒常性を破綻させていることが示唆された。

　細胞内ATP、ADPおよびAMPは高速液体クロマトグラフィーにより測定した。ATPはすべての細胞において、XOD添加後60分までに急速に低下した。しかしながら、ほとんどすべての細胞が死滅した150分時においてもATPが検出されたことから、このATPの低下と細胞外フリーラジカルによる細胞死との関連は少ないものと考えられた。

　次に、観察されたCa²⁺の流入の経路を明らかにするために4種の特異的Ca²⁺阻害薬の細胞死に対する効果を検討した。HV16-4においてはLタイプの電位依存性Ca²⁺チャネル(VDCC)阻害薬であるベラパミルおよびニフェジピン、NタイプのVDCC阻害薬であるネオマイシンがCa²⁺iの増加と細胞死の遅延(無添加時のそれぞれ100、80および20%増)に効果を示した。一方、PC12ではベラパミルとネオマイシン(無添加時のそれぞれ60および20%増)が、C6ではベラパミル(無添加時の30%増)が効果を示した。したがって、細胞外フリーラジカルによるCa²⁺iの増加はHV16-4およびPC12細胞は主にLおよびNタイプのVDCCを、C6細胞ではLタイプのVDCCを介したCa²⁺の流入によるものと考えられた。

　以上の結果から、細胞外に発生したフリーラジカルは細胞膜に何らかの酸化的傷害を引き起こすことでLあるいはNタイプのVDCCの活性化を招来し、Ca²⁺iを増加させ、細胞死を引き起こすと考えられた。

　ヨード酢酸(IAA)は解糖系を抑制することで化学的虚血/低酸素状態を引き起こし、細胞に酸化ストレスを与え、さらに、細胞内抗酸化系酵素を阻害し、フリーラジカルを産生することが知られている。そこで、第3章ではIAAによる細胞内のフリーラジカルに暴露したHV16-4、PC12およびC6細胞について、第2章と同様にCa²⁺i、脂質過酸化物、細胞内エネルギー代謝産物(ATP、ADPおよびAMP)、および細胞死に対するCa²⁺拮抗薬ならびに抗酸化剤の効果を検討した。

　1mMIAAの添加によりすべての細胞において、TBARSの著増が観察され、細胞内フリーラジカルが発生していることが確認された。したがって、以下の実験は1mMIAA添加とした。

　すべての細胞において、IAA添加後Ca²⁺iは漸次増加し、60分までに細胞死を示すPlの蛍光の増加が観察された。平均生存時間は54.3±12.2(HV16-4)、34.2±15.3(PC12)、および56.6±9.3(C6)分であった。また、Co²⁺はすべての細胞において、Ca²⁺iの増加と細胞死を遅延させた。このことから、細胞外フリーラジカル暴露と同様、細胞内フリーラジカル暴露によるHV16-4、PC12およびC6細胞の細胞死においてもCa²⁺iの増加が重要な役割を果たしていると考えられた。

　一方、ATPはすべての細胞において、IAA添加後5〜15分までに急速に低下した。この低下はTBARSやCa²⁺iの増加に先行することから、IAAによる細胞死ではATPの枯渇が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

　次に、Co²⁺がCa²⁺iの増加と細胞死の遅延に効果があり、TBARSが増加を示したので、2種のVDCC阻害薬(ベラパミルとネオマイシン)と抗酸化剤(-トコフェロール)の細胞死に対する効果を検討した。HV16-4細胞では、ベラパミル、ネオマイシンおよび-トコフェロールのいずれについても効果は観察されなかったが、PC12では3種の薬剤いずれにおいてもCa²⁺iの増加と細胞死の遅延が認められた。一方、C6細胞では-トコフェロールにのみCa²⁺iの増加と細胞死の遅延に効果が認められた。したがって、HV16-4細胞で認められたCa²⁺iの増加はLおよびNタイプのVDCC以外の経路が関与しており、また、-トコフェロールの効果が認められなかったことから膜脂質過酸化よりはむしろATPの急激な低下が細胞死を引き起こしたものと推測された。一方、PC12細胞では、IAA処置で発生した細胞内フリーラジカルによる膜脂質の過酸化が主にLおよびNタイプのVDCCを介したCa²⁺iの増加を引き起こし、C6細胞では、膜脂質の過酸化によりLおよびNタイプのVDCC以外の経路によるのCa²⁺iの増加が細胞死を引き起こすと考えられた。したがって、IAA処置で発生した細胞内フリーラジカルは神経細胞の種類により異なったメカニズムで細胞死を引き起こしていると考えられた。

　以上の結果から、細胞外で発生したフリーラジカルは同一のメカニズム、すなわちVDCCの活性化によるCa²⁺の流入により細胞死を引き起こすのに対し、細胞内で発生したフリーラジカルは神経細胞の種類により異なったメカニズムで細胞死を引き起こすことが明らかとなった。