FHV-1感染症に対するワクチンには、現在まで低温継代により弱毒化されたF-2株が広く用いられているが、野外株と区別できるワクチンマーカーをもたない。最近、ウイルスに特異的なチミジンキナーゼ(TK)遺伝子が欠損した組換えウイルスは宿主に対する病原性が著しく低下することが他のアルファヘルペスウイルスで報告されている。本章では、TK遺伝子を欠損させた組換えFHV-1を作出し、in vitroでの増殖性状を検討した。

　まず、当教室で分離され病原性を保持しているFHV-1継代株C7301株のTK遺伝子の塩基配列(1029bp)を決定した。さらに、そのTK遺伝子内のEcoRV-SmaI site(450bp)を欠損させたトランスファーベクター(pfTK-SB△SE)を、FHV-1C7301株感染細胞由来のDNAと共に猫の腎臓由来の株化細胞(CRFK)に同時にトランスフェクションすることで、TK遺伝子内の450bpが欠損している組換えFHV-1(C7301dlTK)を作出した。C7301dlTKのTK遺伝子内の欠損はPolymerase chain reaction(PCR)及びサザンブロット解析により確認した。CRFKにおけるC7301dlTKの増殖能は、TK活性を持つ親株C7301のそれと同じであった。しかし、C7301dlTKのプラークの大きさはC7301のそれより有意に小さかった。本章は遺伝子組換えによる新たなFHV-1ワクチンの構築を報告したものである。

　第1章で述べられたTK遺伝子を欠損させた組換えFHV-1、C7301dlTKの病原性並びにワクチンとしての効果を評価するために、自然宿主である猫を用いて感染実験を行った。

　ワクチン未接種で中和抗体価陰性、ウイルス分離陰性の約3カ月齢の猫4匹2群にそれぞれ組換えウイルスC7301dlTKもしくは親株C7301を眼窩内、鼻内及び口内に接種した。その結果、親株C7301を接種した群はすべて発熱や結膜炎を伴う典型的なFVR症状を呈したのに対して、組換えウイルスC7301dlTKを接種した群は軽度なくしゃみや鼻汁排出、流涙を数匹の検体で観察したのみであった。体重の増加率も親株C7301接種群は鈍かったのに対し、C7301dlTK接種群は一定の増体を観察した。C7301dlTKを接種した群からの分離ウイルス量はC7301接種群よりやや少ないものの一定期間高濃度で分離された。3週間後のC7301接種群及びC7301dlTK接種群の猫の中和抗体価はそれぞれ16〜32倍及び4倍であった。また、排泄されたウイルスのTK遺伝子をPCR法にて検索した結果、C7301dlTK接種群の猫は接種ウイルス同様の欠損を保持していた。つまり、C7301dlTKにおける人為的な欠損は、TK活性を持つ野外株と容易に区別できる遺伝子マーカーとなりうることを示唆している。さらに現行のワクチン接種法に従って組換えウイルスC7301dlTKを3週間間隔で2回、新たな群の猫の筋肉内に接種し、そのワクチン効果を検討したところ、後の眼窩内、鼻内及び口内への強毒株C7301の攻撃に対して十分に発症を防御した。

　組換えFHV-1、C7301dlTKは野外株と区別できる有用な遺伝子マーカーを持つ新たなワクチンとしてのみならず、組換え多価ワクチンを作出するためのウイルスベクターとしても期待された。

　第2章でFHV-1のTK遺伝子を欠損させた組換えFHV-1、C7301dlTKは親株C7301と比べて著しく弱毒化していることを述べた。本章ではC7301dlTKをワクチンベクターとして用い、他の猫の重要な上部呼吸器疾患の原因ウイルスであるFCVに対する免疫原を発現する組換えFHV-1の作出を試みた。

　第1章で用いたpfTK-SB△SEの独特なSmaI siteに、日本で分離されたFCV継代株であるF4株の感染防御に関与するカプシド蛋白をコードする遺伝子を挿入したトランスファーベクターを作製し、常法に従って組換えウイルスC7301dlTK-Capを作出した。本組換えウイルスのカプシド遺伝子の挿入はPCR及びサザンブロット解析により確認した。間接蛍光抗体法にて検討した結果、C7301dlTK-Capが感染したCRFK細胞は、用いたすべてのFCVカプシド蛋白に特異的なモノクローナル抗体と反応した。また、イムノブロット解析により本組換えウイルスは主にTKのN末端部位とFCVカプシド蛋白が融合して発現していることが観察された。さらにC7301dlTK-CapもしくはC7301dlTKをSpesific-Pathogen Free(SPF)猫に強制感染させた結果、C7301dlTK-Capを接種した猫のみFCVに対する中和抗体が誘導された。

　今回の結果より、猫においてFCVに対する中和抗体を誘導できる組換えFHV-1の作出に成功した。

　第3章で述べられたC7301dlTK-Capをワクチンとして接種した猫が、後のFCV及びFHV-1の強毒株の攻撃に対してどの程度防御効果を示すかを検討した。

　感染実験は、約12週齢のSPF猫を各群5匹に分け、ワクチンとしてC7301dlTK-CapもしくはC7301dlTKを接種した群とCRFK細胞培養上清のみを接種したワクチン未接種群の計3群でおこなった。ワクチンウイルスは眼窩内、鼻内及び口内に3週間間隔で2回接種し、その後4週間目にFCV、強毒F4株を、続いて8週間目にFHV-1、強毒C7301株を用いて同じ感染経路より攻撃した。

　すべての猫は攻撃試験前まで目立った症状を呈さなかった。しかしながら、FCV攻撃後C7301dlTK接種群及びワクチン未接種群の猫は口内炎や鼻端部潰瘍を含むFCV感染症の典型的な症状を呈したのに対して、C7301dlTK-Cap接種群の猫は2匹において口腔内に軽度のびらんもしくは発赤をそれぞれ観察したのみであった。さらにFHV-1を攻撃した結果、ワクチン未接種群の猫はすべて発熱や結膜炎を伴う典型的なFVR症状を呈したのに対して、C7301dlTK-Cap接種群及びC7301dlTK接種群の猫は軽度なくしゃみや流涙を数匹の検体で観察したのみであった。以上の結果より、組換えウイルスC7301dlTK-CapはFCV及びFHV-1感染による発症を有意に防御できることが明らかになった。

　本研究で、野外株と区別できる遺伝子マーカーを持つ組換えFHV-1ワクチンの作出と、FHV-1をベクターに用いてFCV及びFHV-1両感染症に対する組換え2価ワクチンの作出に成功した。共に猫を用いた感染実験にてそのワクチン効果を確認した。これらの結果は、FHV-1及びFCV感染症に対する新たなワクチンの開発に有用な知見を与えると思われ、今後更なる発展が期待される。