PC12D細胞では、無刺激下ではzif268 mRNAは検出されないが、ムスカリン受容体(mAChR)アゴニストのカルバコールの投与で大量かつ一過性のzif268 mRNAの発現が見られる。PC12細胞にはm4サブタイプのmAChR mRNAのみ存在するとの報告があるが、PC12D細胞ではm4に比べて少量ながらm1 mRNAも発現していることが分かった。ヘビ毒由来のm1特異的なアンタゴニストであるm1-Toxin前処理によって、カルバコールによるzif268mRNA発現が完全に抑えられた。このことからm1 AChRを介してzif268 mRNAの発現が促進されることが分かる。また、カルバコールによるPIP₂代謝促進及びzif268 mRNA発現促進の用量-作用曲線はほぼ等しかった。PIP₂代謝活性化はDAG産生からPKC活性化、IP₃産生から細胞内へのCa²⁺放出につながる。PKC特異的な阻害剤であるGF109203Xの前処理によって、カルバコールによるzif268 mRNAの発現が部分的に抑制された。このことからzif268 mRNA発現に対するPKCの一定の寄与が考えられる。GF109203X抵抗性のzif268 mRNA発現は、さらにEGTAを加えることで消失した。EGTA存在下では、カルバコール投与による細胞内Ca²⁺ストアからの一過性のCa²⁺の放出に引き続く細胞外からのCa²⁺流入が抑えられた。以上より、m1 mAChR活性化によるPKC活性化及び細胞外からのCa²⁺流入それぞれが、部分的に独立にzif268 mRNAの発現促進に寄与すると結論した。また、細胞内のCa²⁺ストアからの一過性の放出だけではzif268 mRNAの発現には不十分であり、引き続き細胞外からCa²⁺が流入して細胞内Ca²⁺濃度が上昇し続けることが発現に必要であることも分かった。

　上記の結果を踏まえ、PC12D細胞におけるmAChR活性化によるCa²⁺流入機構の解明を目的として、Fura-2蛍光測定法を用いて細胞内Ca²⁺濃度を調べた。mAChRの活性化によって、細胞内Ca²⁺ストアからの放出と、それに引き続く細胞外からの流入による持続的なCa²⁺濃度上昇が起こる。PC12の亜株であるPC12-64細胞におけるmAChR活性化による細胞内へのCa²⁺流入は、細胞内Ca²⁺ストアが空になることに引き続くCa²⁺流入である"capacitative entry"と、受容体が直接作用する"receptor operated channel"の双方が機能するといわれている。

　タプシガルギンは細胞内のCa²⁺ストアを枯渇させてcapacitative entryを起こすといわれている。PC12D細胞において、タプシガルギン、カルバコール、或いは両方を投与したときの細胞内Ca²⁺濃度変化及びCa²⁺流入速度について調べた。この結果、PC12D細胞におけるmAChR活性化は、"receptor operated channel"とは無関係であり、細胞内のCa²⁺ストアを枯渇させた結果引き起こされるcapacitative entryのみによって、Ca²⁺を流入させることが示唆された。

　電位依存性Ca²⁺チャネル(VOCC)の抑制についても調べた。KCl投与によるVOCCを介するCa²⁺の流入は、タプシガルギン前処理の影響を受けなかったが、カルバコール或いはホルボールエステルによる前処理で抑制された。このことから、m1-mAChRを介したPKC活性化によって、電位依存性Ca²⁺チャネルの抑制が起こると結論した。一方、KCl投与による脱分極の結果、mAChR活性化によるCa²⁺流入が抑制されることが分かった。脱分極とmAChR活性化は、互いのCa²⁺流入を抑制しあう。

　PC12D細胞において、NGF、カルバコール、A23187(カルシウムイオノフォア)の投与は、それぞれMAPK(mitogen activated protein kinase)を活性化する。c-fos遺伝子では、MAPKが活性化されることで、SRE(serum response element)を介する転写の活性化が起こる。zif268遺伝子も5’上流450bpの範囲にSREを含むことから、この領域がMAPK活性化に引き続いた遺伝子発現をつかさどると考えられてきた。

　PC12D細胞において、どの細胞内情報伝達系及び転写調節エレメントがzif268遺伝子の発現に関与しているかを詳しく知る目的で、SRE配列を含むzif268遺伝子プロモーター領域2.5Kbをルシフェラーゼ遺伝子につないだ発現ベクターを作製し、刺激に対するプロモーター領域の転写活性化能を調べた。この結果、zif268遺伝子の5’側領域2.5Kbによる転写活性化能は、NGF刺激に比べてカルバコール、A23187投与では著しく弱く、ルシフェラーゼの発現とzif268 mRNAの発現パターンが一致しないことが分かった。今までの報告とは異なり、遺伝子上流2.5Kb以外のDNA配列か、もしくは転写後調節が、zif268 mRNA発現に関与していると考えられる。

　また、A23187或いはカルバコールによる細胞内Ca²⁺濃度の上昇が、NGFによる転写活性化を50%程度抑えることが分かった。細胞内Ca²⁺濃度の上昇は、MAPKを活性化する一方で、このMAPK/SREを介するzif268遺伝子の転写活性化の情報伝達をMAPKより下流のどこかの段階で抑制すると考えられる。