ホルモンや神経伝達物質などの様々な刺激によって細胞内にはイノシトール1,4,5三リン酸(IP₃または(1,4,5)IP₃)が産生される。IP₃は細胞質を拡散し細胞内Ca²⁺プールである小胞体上のIP₃受容体(IP₃R)に結合して細胞質へのCa²⁺放出を引き起こす。細胞質内で上昇したCa²⁺イオンは細胞に様々な生理機能を引き起こすと考えられている。このようにIP₃RはIP₃という情報をCa²⁺という情報に変換する際、中心的な役割をになう分子である。

　現在、哺乳動物には少なくとも3種類の異なった遺伝子によってコードされるIP₃Rが存在することが明らかとなっている。小脳に豊富に存在するタイプ1IP₃R(IP₃R1)は2749アミノ酸(313kDa)からなる巨大蛋白質である。精製小脳IP₃Rを用いた実験やIP₃R1のcDNA発現実験から、IP₃Rは四量体を形成しIP₃依存性Ca²⁺チャネルとして機能することが示されている。IP₃R1は構造的に3つの部分に分けられる。N末端側の細胞質に存在する大きな部分(全体の83%)、小胞体膜を6回貫通しCa²⁺チャネルとして機能すると考えられている部分(11%)とC末端側の細胞質に存在する部分(6%)である。

　1分子のIP₃Rには1分子のIP₃が結合すること、その解離定数(Kd)は約100nMであることが精製小脳IP₃Rを用いた実験から示されている。IP₃結合部位を決定するために、欠失変異体を培養細胞で発現させる実験が行われた。この実験からIP₃の結合はIP₃R1のN末端650アミノ酸内で起こること、結合はIP₃Rの四量体形成に依存しないことが示された。またこの領域内のかなり小さな欠失でもIP₃結合活性が完全に消失することも示された。大腸菌内で発現させたグルタチオンS-トランスフェラーゼ融合IP₃R蛋白を用いた実験から、IP₃結合にはN末端576アミノ酸が十分であることが示されている。同時に、この領域からN末端またはC末端をさらに欠失させるとIP₃結合活性が消失することも報告された。さらに、光親和性IP₃アナログにより小脳IP₃Rのアミノ酸471-501の領域が標識された。これらからIP₃結合部位はIP₃R1のN末端576アミノ酸内存在するいくつかのモチーフによって構成されることが想像された。

　IP₃の構造はイノシトール環の1,4,5位につくリン酸基によって特徴づけられる(図)。様々なイノシトールリン酸のアナログを用いたCa²⁺放出実験から、IP₃Rは非常に厳密にリガンドの構造を認識することが示されている。リン酸基の数と位置がCa²⁺放出能に大きく影響することから、3つのリン酸基を認識する部位がIP₃そのものの結合において重要な役割を担うことが示唆されている。これらの結果からIP₃結合部位は塩基性アミノ酸からなるプラスに荷電したポケットで、静電気的な力を介してIP₃のリン酸基と結合するというモデルが提唱された。

図)イノシトール1,4,5三リン酸の構造

　IP₃結合に塩基性アミノ酸の関与が示唆されてきたにも関わらず、これまでIP₃Rのリガンド結合領域の詳細な構造と機能の解析はなされていなかった。IP₃結合部位が幾つのアミノ酸から構成されるのか?いかなるアミノ酸がIP₃結合に関与するのか?を分子生物学的手法を用いて明らかにすることを目的とした。

　マウスIP₃R1のN末端734アミノ酸(T734)はIP₃結合領域(アミノ酸1-650)とモノクローナル抗体(mAb)4C11のエピトープ(678-699)を含む。T734をコードするcDNAをpETベクターにクローン化し発現プラスミドを構築した。プラスミドを導入した大腸菌株BL21(DE3)をアンピシリン存在下に培養した。IPTG添加によって発現誘導した後14℃で20時間培養後、細胞を回収した。大腸菌を破壊した後、遠心しその上清をサンプルとして以降の実験に用いた。組換え蛋白の発現はmAb4C11を用いたウエスタンブロットにより確認し、デンシトメトリーを用いて定量化した。IP₃結合アッセイは[3H](1,4,5)IP₃を用いて行った。

　大腸菌内で機能的なIP₃結合領域を発現する系を確立した。大腸菌の培養温度を37℃にした場合、可溶性画分にはT734は検出されず発現蛋白はすべて不溶性の沈殿画分に回収された。しかし、IPTG添加後培養温度を28℃以下にした場合、可溶性画分にT734が検出された。可溶性画分のT734は高い[3H]IP₃結合活性を示した。様々なイノシトールリン酸を用いた[3H]IP₃結合の競合阻害実験から結合特異性を検討した。結合特異性は(1,4,5)IP₃>(2,4,5)IP₃>(1,3,4,5)IP₄(4,5)IP₂の順であった。スキャッチャード解析からT734の(1,4,5)IP₃に対する解離定数(Kd)50nMを得た。これらの結果は小脳IP₃Rが示す結合特異性とKdにほぼ等しいことから、大腸菌で発現させたT734は小脳IP₃Rのリガンド結合部位と同じ構造をとると考えられた。

　この系を用いて、変異体蛋白のIP₃結合活性を解析することによりIP₃結合に関与する部位の同定を試みた。

　はじめにIP₃結合領域の境界を明確にすることを目的に、T734のコンストラクトを基に2つの内部欠失変異体と15個のN末端欠失変異体を作製した。アミノ酸579-649を欠く変異体はIP₃結合活性を示したのに対し、568-649を欠く変異体のIP₃結合活性は消失した。この結果から、IP₃結合領域のC端側の境界はアミノ酸568から578の間にあると考えられた。これはNewtonら(1994)が報告したN末端576アミノ酸がIP₃結合活性をもつという結果に一致する。T734からN末端31アミノ酸を削るとIP₃結合活性は消失した。N末端215アミノ酸まで欠失を徐々に大きくさせてもIP₃結合活性は検出されなかった。ところがN末端220アミノ酸を欠いた変異体は再びIP₃結合活性を示した。この結合活性の回復はN末端223と225アミノ酸を欠いた変異体でも観察された。N末端の228アミノ酸以上を欠いた変異体では再びIP₃結合活性が消失した。これらの結果から、IP₃結合領域のN端側の境界はアミノ酸226から228の間にあると考えられた。

　欠失変異体の実験からアミノ酸226-578の領域がIP₃結合に必要な最小領域であることが分かった。そこでこの領域が特異的IP₃結合に十分な領域であるかどうかを検討することを目的に、アミノ酸224-579の356アミノ酸を発現させた。この356アミノ酸からなる発現蛋白は高いIP₃結合活性(Kd＝2.3nM)とT734と同じ結合特異性を示したことから、この領域がIP₃結合に十分であることが分かった。この領域がIP₃結合コアを形成することが示唆された。

　いかなるアミノ酸がIP₃結合に関与するかを明らかにするために、Argとリジン(Lys)に対して部位特異的変異を導入した。標的としたArgとLysは、以下に記す3つの基準に従って選んだ。アミノ酸226-578に存在し、(i)これまでクローニングされたすべてのIP₃Rで保存されているもの(26ヵ所)、(ii)完全に保存されていないが保存性が高いもの(7ヵ所)。(iii)アミノ酸1-225または579-650に存在し、なおかつコンピュータで予測されるサーフェースプロバビリティが高い領域にあるもの(8ヵ所)。以上、41ヵ所の塩基性アミノ酸を単独かまたは2つ以上をまとめて、中性アミノ酸であるグルタミン(Gln)に置換した。

　部位特異的変異体はIP₃結合活性を基に4つのグループに分類できた。(i)IP₃結合活性が完全に消失した変異体、(ii)部分的に結合活性が消失した変異体、(iii)結合活性が上昇した変異体、(iv)結合活性が変化しなかった変異体である。1アミノ酸置換によりIP₃結合活性が減少した10ヵ所のアミノ酸(Arg-241,Lys-249,Arg-265,Arg-269,Arg-504,Arg-506,Lys-508,Arg-511,Arg-568,Lys-569は)はすべてアミノ酸226-578の領域に位置していた。またこれらのアミノ酸はすべてのIP₃Rで保存されていたことから、機能の重要性が示唆された。これらのうち、Arg-265、Lys-508、Arg-511は1アミノ酸置換によりIP₃結合活性が完全に消失したことから、IP₃結合に必須なアミノ酸であると考えられた。

　Arg-568をGlnに置換した変異体は部分的にIP₃結合活性を欠くが、この変異体のイノシトールリン酸に対する結合特異性((1,4,5)IP₃(2,4,5)IP₃>(4,5)IP₂>(1,3,4,5)IP₄)は変異をもたない野生体の結合特異性と異なっていた。Arg-568はリガンド結合の特異性に関与するかもしれない。

　IP₃Rが3次構造をとったとき、アミノ酸226-578に分散して存在する10ヵ所の塩基性アミノ酸が互いに近接しプラスに荷電したポケットを形成しIP₃のリン酸基との結合に関与することが示唆された。