p53遺伝子の検索はDNA結合領域をコードし、変異が多く見つかっているエクソン4〜9について行った。新鮮凍結材料からDNAを抽出し、目的とするエクソンをPCRにより増幅後、サブクローニングし、373A DNA Sequencer(Applied Biosystems)によって塩基配列を決定した。最低4クローンを検索し、変異の見つかったものについては、同じ変異を持つクローンを他に確かめた。

　蛋白の発現の検索については、パラフィン包埋ブロックから薄切した標本に免疫組織化学的染色を行った。ヒストファインSAB-POキット(ニチレイ)を用い、説明書に従って行った。一次抗体はマウスモノクローナル抗MT抗体(E9)、ウサギポリクローナル抗GST抗体、マウスモノクローナル抗Hsp27抗体(2B4)、ウサギポリクローナル抗Hsp70抗体、マウスモノクローナル抗LRP抗体(LRP56)、マウスモノクローナル抗p53抗体(DO7)を使用した。

　免疫組織化学的染色の評価は臨床情報を伏せて行った。MT、GST、Hsp27、Hsp70、LRPの免疫組織化学的染色の結果は腫瘍細胞のうちの陽性細胞の占める割合で次の4群に分けた。-:0%、±:10%未満、+:10%以上70%未満、++:70%以上の細胞がそれぞれ陽性であるもの。過剰発現は+または++と判定されたものとした。p53蛋白は腫瘍細胞の10%以上が陽性であるものを過剰発現とした。

　p53遺伝子の変異による壊死率の差の検定にはウィルコクソン検定、2変量間の分布の偏りの検定にはフィッシャーの直接確率検定を使用した。蛋白の発現の差については対応のあるウイルコクソン検定を行った。生存率はカプラン・マイヤー法によって求め、生存率の差の検定はログランク検定を行った。生存率の多変量解析にはコックスの比例ハザードモデルを用いた。

　15例中5例にミスセンス変異が見つかった。これは他の研究の範囲内(20-65%)である。特定の変異部位は無かったが、一つは変異のホットスポットとされている第248アミノ酸残基に見つかった。免疫組織化学的染色では15例中5例に過剰発現を認めた。腫瘍細胞の核にのみ陽性像を認めた。変異と蛋白の過剰発現には有意な関連は無かった。また、変異の有無や過剰発現による生存率や化学療法の効果の差は無かった。症例数が少なく、高齢例や稀な組織亜型など症例のばらつきがあったために傾向がつかみ難かった可能性が考えられた。

　各蛋白の発現を免疫組織化学的染色にて検索した結果、下表のように各蛋白の過剰発現が観察された。

図表

　MT、GST、Hsp70、LRPの陽性像は細胞質と核に見られた。Hsp27の陽性像は細胞質のみ、p53蛋白の陽性像は核のみに見られた。

　手術時には術前化学療法が施されており、蛋白の発現に治療の影響があることが予想される。生検と手術との間でGSTの陽性率の有意な減少、LRPには有意な増加が有った。GSTは他に喉咽頭癌で放射線治療後に発現が減少したとする報告があるが、理由はよく分からない。LRPの増加は術前化学療法による誘導、あるいは発現細胞が化学療法を生き残った結果と考えた。

　手術時はp53蛋白以外の蛋白の過剰発現相互間に有意な関連(p<0.05)が有った。また、手術時のMT、GST、LRPの過剰発現とIII期、術前化学療法の非著効の間に関連が有った。III期の腫瘍がII期の腫瘍より大きいこと、化学療法の効きが悪い例が多いことも合わせて考えると、進んだ病期の腫瘍は大きいために薬剤が十分に行き渡り難く、生き残った腫瘍細胞にこれらの蛋白が共に誘導されるか、あるいは共に発現している細胞が生き残ったために、手術時には過剰発現の相互に関連がみられたのではないかと考えた。生検、手術時共にHsp27とp53蛋白の過剰発現相互の関連が有ったが、理由はよく分からない。

　生検時のHsp27とp53蛋白の過剰発現と悪い予後との有意な関連(p<0.01)が有ったが、他の蛋白の過剰発現と予後との間には有意な関連は無かった。腫瘍本来のHsp27とp53の過剰発現が予後不良と関連が有るといえる。しかし、生検時の各蛋白の過剰発現と術前化学療法の効果との関連は無かった。手術時では、MT以外の総ての蛋白の過剰発現と悪い予後との有意な関連(p<0.05)が有ったが、上記のように手術時の蛋白の発現は他の因子の影響を受けていると考えられるので、各蛋白の過剰発現が直接に予後と関連が有るとは言えない。転移時の過剰発現と予後の関連は無かった。蛋白以外では、病期による生存率の差が有った(p＝0.02)。

　Hsp27とp53蛋白の過剰発現の生存率に及ぼす影響が独立したものか否か、生検時のデータで比例ハザードモデルを用いた多変量解析を試みた。病期によって層別化し、組織亜型(骨芽細胞型)、腫瘍の最大径によって補正したハザード比を求めた。その結果、Hsp27、p53蛋白共に有意な予後因子とはならなかった。両蛋白の過剰発現の関連が有ったため、両者の影響が分散することになったと考えられた。

　骨肉腫の予後の改善にはこれらの蛋白の発現に関する研究が重要と考える。