CAGプロモーターの下流にT7RNAポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ非増殖型アデノウイルス(AdexCAT7)をMiyakeらの方法に従い作製した。このウイルスを各種動物細胞におけるT7ポリメラーゼの発現および活性の解析を行った。ヒト肝細胞癌由来のHepG2、Huh7、FLC4、ヒト子宮頚癌由来HeLa,サル腎由来COS7及び豚腎由来CPKなどの各種動物細胞にm.o.i.4,20および100で感染させ、感染後2日目の細胞内のT7ポリメラーゼ活性を、T7プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型にして[³H]UTPの取り込みによって測定した。いずれの細胞でもm.o.i.20で最も高い活性が認められたが、特に、HeLaとHepG2細胞で高い取り込みが認められた。一方、m.o.i.100ではウイルスによる細胞障害性が強すぎるために、いずれの細胞でもm.o.i.20に比較すると活性が著明に低下していた。以上の結果から以下の実験は全てm.o.i.20で行った。さらに、各種動物細胞にAdexCAT7を感染させ、T7ポリメラーゼの発現を経時的にウエスターンブロッティング法にて解析したところ、感染後11日までその発現を確認することができた。

　HCVミニジーンRNAを合成するために、T7プロモーターの3’末端からGを2つ除いたものに、キャップ非依存的に翻訳可能なIRES活性を持っているHCVの5’UTR、ルシフェラーゼ遺伝子、HCVのNS5BのC末端約半分と3’UTR、HDVのリボザイムそしてT7ターミネーターを含んだレポータープラスミド(pT7HCVLuc)を作製した。このプラスミドから転写されるRNAは、5’末端がGから始まりHCVRNAと一致し、しかもルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンも本来のHCVのコア蛋白と同じ位置、すなわち5’末端から342番目になるように設計した。このプロモーターは本来のT7プロモーターに比べプロモーター活性が低下することが知られているが、フラビウイルスなどの感染性クローンでは、RNAの5’末端の配列が本来のウイルスRNAと同一であることが重要であると知られており、あえてこのように設計した。

　陰性対照として、pT7HCVLucからプロモーターとHCVの5’UTRを除き、新たにauthenticなT7プロモーターを挿入したpT7Lucを構築した。T7ポリメラーゼには5’末端にキャップを付加する活性がなく、このプラスミドから転写されたRNAにはキャップ構造がないことから細胞内での翻訳はほとんど行われないものと考えられる。陽性対照としてauthenticなT7プロモーター下に強いIRES(Internal Ribosomal Entry Site)活性を示すEMCVの5’UTRを持ち、その下流にルシフェラーゼ遺伝子、そしてT7ターミネーターを含んだpT7EMCLucを構築した。これら二つの対照プラスミドのT7プロモーターはpT7HCVLucと比べ転写活性は強いものと思われる。

　そこで、まず各リポータープラスミドから細胞内で転写されるRNA量を比較検討した。各種細胞にAdexCAT7を感染させ24時間後に各リポータープラスミドをトランスフェクトし、さらにその6時間後に、細胞から全RNAを抽出し、ディゴキシゲニンでラベルしたルシフェラーゼRNAをプローブとして用いてノーザンブロット法を行った。pT7HCVLucから転写されるRNAはpT7EMCLucやpT7HCVLucなどと比較して著明に低下していることが認められた。さらに、この系によって細胞内で合成されたHCVのミニジーンRNAの5’末端の塩基配列が設計した通りに細胞内でも合成されていることをシークエンスで確認した。

　各種動物細胞にAdexCAT7を感染させ24時間後にリポータープラスミドをトランスフェクトし、24時間後にルシフェラーゼの活性を測定した。その結果、調べたほとんどの細胞で、EMCVのIRESを持つpT7EMCLucで最も高い活性を示したが、唯一、FLC4細胞のみがHCVのIRESを持ったpT7HCVLucで最も高い活性を示した。一方、pT7Lucではどの細胞でも活性が認められなかった。次に、EMCVとHCVのIRESの翻訳効率の違いを検討するためにpT7EMCLucとpT7HCVLucを鋳型にしてin vitroでRNAを合成し、同じ量のRNAを細胞にトランスフェクトしてルシフェラーゼの活性を測定した。調べたほとんどの細胞ではHCVのミニジーンRNAとEMCVのIRESを持つRNAでルシフェラーゼ活性に有意な差は認められなかった。一方、FLC4細胞では、トランスフェク後12時間以降48時間にわたり、HCVのミニジーンRNAの方が、EMCVのIRESを持つRNAよりも高い活性を示した。上記の結果から、FLC4細胞には、HCVのミニジーンRNAの翻訳効率を上昇させる、あるいはこのRNAを選択的に安定化させる何らかの因子が存在することが示唆された。

　この系を用いて実際にHCV蛋白を発現できるか否かを調べるために、pT7HCVLucのルシフェラーゼ遺伝子の代わりにHCVのコア遺伝子を挿入したプラスミドを構築した。FLC4細胞にAdexCAT7を感染後24時間後にこのプラスミドをトランスフェクションし、2日から4日後にかけて細胞を回収し、コア蛋白の発現をウエスタンブロット法で解析した。トランスフェクション後2-4日目にかけてコア蛋白の発現が確認できた。