粥状動脈硬化などの血管病変においては、マクロファージ(M)やリンパ球などの炎症細胞が浸潤し、種々のサイトカインを産生している。誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS:inducible nitric oxide synthase)は、このような血管病変で多量に発現することが示されている。また粥状硬化巣においては、Mとともに血管平滑筋細胞(VSMC:vascular smooth muscle cell)が一酸化窒素(NO:nitric oxide)の主要な産生源である可能性が示唆されている。一方、プロスタグランジンD₂(PGD₂:prostaglandin D₂)は多くの臓器で合成される主要なPGであり、血管系では、内皮細胞・血小板・M・肥満細胞などの粥状硬化巣の構成細胞から産生される。特に肥満細胞は、アテロームや泡沫細胞の形成に重要な役割を演じるが、この肥満細胞の分泌顆粒の一部は、シクロオキシゲナーゼを含有しPGD₂合成能を有する。しかしこうした血管病変におけるPGD₂の役割は不明である。我々は、PGD₂とNOのクロストークを想定し、VSMCにおけるNOの生合成およびiNOSの蛋白・遺伝子レベルの代謝に及ぼすPGD₂の効果について検討した。

　◆細胞培養:雄WKYラットの胸部大動脈よりexplant法にてVSMCを単離し培養した。

　◆NO産生量測定:interleukin-1(IL-1)およびtumor necrosis factor(TNF-)で培養VSMCを刺激してiNOSを誘導し、培養上清中のnitrite(NO^2-)蓄積量をGriessの方法にて発色定量した。

　◆iNOS触媒活性測定:PGD₂のiNOSに及ぼす直接作用を確認するため、上記のサイトカインでiNOSを誘導させた培養VSMCの細胞ホモジネートに、[³H]arginineとともに諸濃度のPGD₂またはN^G-monomethyl-L-arginine(L-NMMA)を添加し、2時間・37℃で反応させた。その後Dowex AG50WX-8(Na⁺)resinを用いて未反応の[³H]arginineを除去し、[³H]citrullineへの転換量を測定して、iNOSの触媒活性とした。

　◆蛋白合成量測定:TCA不可溶細胞蛋白分画への[³H]leucineの取り込みを測定した。

　◆iNOS蛋白のWestern blot:種々の刺激後の培養VSMCから、2"5’-ADP sepharoseを用いてiNOS蛋白を部分精製し、ラット iNOSの合成ペプチドに対するポリクローン抗体を用いて、iNOS蛋白発現量をWestern blotで評価した。

　◆iNOS遺伝子のNorthern blotならびにRT-PCR Southern blot:ラットiNOSのプライマーを用いてRT-PCRを行い、その産物をサブクローニングしてiNOS cDNAプローブを作製した。これを用いて、種々の刺激後の培養VSMCにおけるiNOS mRNA発現量をNorthern blotあるいはRT-PCR Southern blotで評価した。

　◆CAT assay:nuclear factor B(NFB)やinterferon regulatory factorl(IRF-1)などの転写因子の作用部位を含むiNOS遺伝子のプロモーター領域(-1.7〜+0.5Kb)をchloramphenicol acetyltransferase(CAT)のレポーター(pBLCAT3)に組み込んだプラスミド(piNOSCAT)を、培養VSMCにリポフェクションにて移入し、種々の刺激の後、細胞抽出液中のCAT活性を1-deoxychloramphenicolから3-acetyl-1-deoxychloramphenicolへの転換量として、シリカゲル薄層クロマトグラフィーにて分画評価した。

　◆VSMCにおけるNO産生に及ぼすPGD₂の効果:

　培養VSMCを20U/ml IL-1または30ng/ml TNF-で、PGD₂(0〜10^-4M)存在下に24時間刺激し、その間の培養上清中のnitrite蓄積量を測定した(Fig.1A,B)。サイトカインの刺激により多量のNO産生が誘導され(49.2±0.57nmoles/10⁶cells/24h byIL-1)、PGD₂(10^-7M以上)はこれを用量依存的に抑制した。

　培養VSMCを、10^-5Mの種々のプロスタノイド(PGD₂,thromboxane A₂ analogue,PGI₂ analogue,PGE₁)と20U/ml IL-1で24時間刺激し、その間のnitrite蓄積量を測定した(Fig.2)。thromboxane A₂(TXA₂)analogueは軽度にNO産生を抑制し、PGI₂ analogue,PGE₁はNO産生量を僅かに増加させた。

　次に培養VSMCを、種々の濃度のIL-1(0〜100U/ml)ならびにPGD₂(0,10^-6M,10^-5M)で24時間刺激し、nitrite蓄積量を測定した(Fig.3)。PGD₂は用量反応曲線を右下方へ移動させた。この結果PGD₂の抑制作用は、サイトカインの受容体における拮抗作用によるものではないことが示された。

　次に培養VSMCを、サイトカイン・カクテルならびにPGD₂(0,3x10^-5M)で刺激し、24時間後までのnitrite蓄積量の経時変化を調べた(Fig.4)。サイトカインの刺激によりnitrite蓄積量は直線性を示さず加速的に増加し、PGD₂はこれを抑制した。

　◆Chronological analysis(Fig.5):培養VSMCをサイトカイン・カクテルで刺激後24時間まで、時間をずらしながらPGD₂(3x10^-5M)を添加し、刺激後24時間のnitrite蓄積量を測定した。刺激開始後6時間以内にPGD₂を添加すると十分な抑制効果がみられたが、それ以降では抑制効果は減弱した。この結果、PGD₂はiNOSの酵素活性自体ではなく、iNOSの発現を抑制することが推察された。

　◆iNOS酵素活性に対するPGD₂の効果(Fig.6):培養VSMCを、サイトカイン・カクテルで12時間刺激後洗浄除去した後、20g/mlのシクロヘキシミド(CHX:cycloheximide)で翻訳を停止し、以降8時間のnitrite蓄積量を測定した。サイトカインと同時にPGD₂(3x10^-5M)を作用させると十分な抑制効果がみられたが(protocol3)、翻訳停止後にPGD₂を作用させても抑制効果は全くみられなかった(protocol2)。この結果、PGD₂がiNOSの酵素活性自体ではなく、iNOSの発現を抑制することが再確認された。

　◆iNOS触媒活性に対するPGD₂の直接効果(Fig.7):細胞ホモジネート中のiNOSの触媒活性に対するPGD₂ならびにL-NMMAの効果を測定した。L-NMMAは用量依存的にiNOSの触媒活性を抑制したが、PGD₂(〜10^-3M)は全く影響しなかった。

　◆全蛋白合成に対するPGD₂の効果(Table):24時間の培養VSMCによる[³H]leucineの取り込みに対するPGD₂(〜10^-4M)の影響はなかった。この結果、PGD₂によるiNOS発現の抑制は、細胞毒性ないし非特異的効果によるものではないと考えた。

　◆iNOS mRNAならびに蛋白発現に対するPGD₂の効果(Fig.8):培養VSMCを、20U/ml IL-1ならびに諸濃度のPGD₂で24時間刺激し、iNOS mRNA及び蛋白の発現量を、Northern blot及びWestern blotにて評価した。PGD₂は iNOS mRNA及びiNOS蛋白の発現を用量依存的に抑制した。

　◆mRNA stability analysis(Fig.9):培養VSMCを12時間IL-1(20U/ml)で刺激後IL-1を洗浄除去し、さらに12時間後にPGD₂(10^-4M)またはvehicleを添加し(前処理)、さらに12時間後に洗浄後再びPGD₂またはvehicleとともに、actinomycin D(AMD)(10g/ml)またはvehicleを添加し(計4群)、以後24時間iNOS mRNAレベルをRT-PCR Southern blotにて追跡した。AMDによる転写停止下でのiNOS mRNAのdegradation rateはPGD₂により影響されなかった(Fig.9A)。またPGD₂存在下では、AMD添加によりiNOS mRNAレベルの減退は亢進せず(むしろ減弱し)、このことからもPGD₂によるiNOS mRNAの不安定化は否定された(Fig.9B)。従って消去法的に、PGD₂によるiNOS遺伝子の転写抑制が示唆された。

　◆PGD₂によるiNOS遺伝子プロモーター転写活性に対する影響(Fig.10):既述のpiNOSCATをトランスフェクトした培養VSMCを、20U/mlIL-1または30g/ml lipopolysaccharide(LPS)、ならびにPGD₂(0〜10^-4M)で24時間刺激し、CAT assayを行った。その結果、PGD₂による転写活性の抑制は認められなかった。

　◆VSMCにおけるNO産生に及ぼすPGJ₂系の効果(Fig.11):PGD₂の代謝産物であるPGJ₂,△¹²-PGJ₂,15-deoxy-△¹²-PGJ₂は、10^-5MにてPGD₂よりも強くNO産生を抑制した。全濃度を通して、NO産生抑制作用は、15-deoxy-△^12,14-PGJ₂が最も強かった。

　PGD₂は培養VSMCにおけるNO産生を抑制した。これは、iNOSの酵素活性自体に対する阻害作用ではなく、iNOS発現過程における転写抑制作用によるものと考えられた。

　近年、粥状動脈硬化などの炎症性血管病変において、iNOSの発現が亢進しているという多くの報告がある。さらに粥状硬化巣においては、MよりもむしろVSMCがNOの主要な産生源である可能性が示唆されている。また粥状硬化巣においては、肥満細胞が病変形成に重要な役割をもつ。一方、PGD₂は内皮細胞・血小板・Mからも産生させるが、さらに、肥満細胞からの分泌顆粒の一部はシクロオキシゲナーゼを含有しPGD₂合成能を有する。以上のことと今回の研究結果より、PGD₂はこのような血管病変において、NOの過剰産生を抑制する局所メディエーターとして存在する可能性がある。

　PGD₂は血小板においてTXA₂のアゴニストとして働くが、VSMCにおいてTXA₂ an alogueは軽度にNO産生抑制効果を示した。またPGD₂は、血小板等においてcAMPを増加させるが、VSMCにおいてcAMPを増加させるPGI₂ analogueやPGE₁はNO産生を抑制しなかった。最近になって、PGD₂の代謝産物であるPGJ₂誘導体の一つが、ある種の核内レセプター(PPAR)のリガンドであることが発見された。当研究においても、PGD₂の代謝産物であるPGJ₂,△¹²-PGJ₂,15-deoxy-△^12,14-PGJ₂は10^-5Mにおいて、より強いNO産生抑制効果を示した。またPGD₂は、NFB・IRF-1・NF-IL6・AP-1(activator protein-1)などの転写調節因子の作用部位を含むiNOS遺伝子プロモーター領域の転写活性を抑制しなかった。以上のことを考えあわせると、PGD₂の細胞内伝達経路は、TXA₂受容体やcAMPあるいは上記諸転写因子を介するのではなく、このようなPGJ₂カスケード及びそれらの核内レセプターを介している可能性も考えられるが、この問題の解明には、今後のさらなる研究が待たれる。