嚢胞性繊維腫症(Cystic fibrosis,CF)は、コーカサス人種において最も頻度の高い致死性遺伝疾患である。その責任遺伝子は1989年に同定され、疾患の原因が気道、腸管、膵外分泌腺など分泌上皮を中心に発現するcAMP依存性Cl^-イオンチャネル(Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator,CFTR)の突然変異であることが判明した。CFに伴う種々の病態のうち、最も重大な問題は慢性呼吸器感染症であり、抗生剤治療の継続にも関わらず、最終的に細菌叢が多剤耐性緑膿菌へと変化、重症肺炎に伴う呼吸不全から死に至る症例が多い。患者の平均寿命は30歳前後である。

　CFに伴う呼吸器合併症に対する積極的治療の試みを大きく分類すると、(1)気道上皮における分泌の改善、(2)局所炎症の制御、および(3)遺伝子突然変異に伴う異常の矯正がある。本論文は、このうち(1)と(3)について、新たな可能性を模索するものである。

　第1部では、慢性肺感染症の原因と考えられる気道上皮の電解質分泌異常について、CFTRの突然変異に伴うcAMP依存性Cl^-コンダクタンスの失調を補間する可能性のあるCa²⁺/カルモジュリン依存性Cl^-分泌機構を、ミクロソームに存在し細胞質内Ca²⁺イオン濃度([Ca²⁺]_i)を制御するCa²⁺-ATPaseの阻害により活性化する試みを報告する。

　Ca²⁺-ATPase阻害剤のthapsigargin(THG)、cyclopiazonic acid(CPA)、および2,5-di-(tert-butyl)-1,4-hydroquinone(DBHQ)は、細胞質内に放出されたCa²⁺の再吸収を阻害することにより[Ca²⁺]_i上昇を惹起することが知られている。DBHQは、毒性の報告されていない市販の合成化学物質で、その化学構造は細胞毒性のあるTHGおよびCPAとは全く関連をもたない。本研究では、全CF患者の約70%がもつ△F508(CFTRにおける第508アミノ残基のフェニルアラニンの欠損)の突然変異を示した患者より樹立されたヒト膵臓由来上皮性細胞CFPAC-1を用いて、DBHQによるCa²⁺依存性Cl^-分泌機構活性化を介したCl^-分泌改善の可能性を検討した。

　まずDBHQは、¹²⁵Iを用いた陰イオン流出率測定実験(Anion efflux study)において¹²⁵I流出率を増加させる効果を示した。これはDBHQがCl^-コンダクタンスを誘導し得ることの間接的証明である。

　続いてCa²⁺感受性色素Fura-2を用いた実験から、DBHQ濃度依存性に[Ca²⁺]_iの上昇が認められ、その効果は25-50Mで最大であった。また細胞外Ca²⁺をBAPTA(1,2-bis-(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid)によりキレートした条件下では、DBHQ(25M)はマイクロソーム内Ca²⁺プールの放出によると考えられる短期的な[Ca²⁺]_i上昇をもたらした。陰イオン流出率測定実験における細胞外液には1.2mMのCa²⁺を含むが、この条件でDBHQ(25M)は持続的な[Ca²⁺]_iの上昇を生じ、一方これはCa²⁺チャネル阻害剤のNi²⁺(5mM)を細胞外液に加えたところ概ね消失した。

　Whole cell patch clamp法による全細胞CTチャネルコンダクタンスの測定では、DBHQを細胞外液に加えると、Ca²⁺/カルモジュリン依存性CTチャネルに特徴的なプロファイルをもつ、外向き整流性全細胞Cl^-コンダクタンスが誘導された。このコンダクタンスは、細胞内に交通する測定用ピペット内溶液へのBAPTA(5mM)添加、および多機能性Ca²⁺/カルモジュリン依存性蛋白リン酸化酵素CaMKIIの阻害性ペプチドであるCaMK[273-302](20M)の添加により消失した。

　CFPAC-1細胞の単層培養にDBHQを加えると、4-5分で細胞ホモジェネート液中にCa²⁺依存性ないし自律性CaMKII活性の有意な上昇が認められた。従ってDBHQは、CaMKIIを介したCa²⁺依存性メカニズムによりCl^-チャネルコンダクタンスを誘導するものと考えられた。

　DBHQの短期的細胞毒性に関する検討では、CFPAC-1細胞を50MまでのDBHQに6時間曝露したが、曝露後における生存細胞数、および曝露開始後48時間までの細胞増殖能に有意な変化は認められなかった。

　これらの結果から、適切な選択的ミクロソームCa²⁺-ATPase阻害剤は、CFの上皮細胞においてCl^-イオンの細胞外への分泌を促進し、治療的に有効である可能性が示された。

　他方、CFに対する遺伝子治療の試みとしては、現在までアデノウイルスベクターおよび陽性脂質リポソーム法による臨床第1相試験が米国および英国で実施されたが、前者に関してはベクター自体の免疫原性が誘導する抗原抗体反応が、また後者は低い遺伝子導入効率が問題となった。遺伝子治療の進展には、より安全で高効率な遺伝子導入法の開発が不可欠である。

　第2部では、センダイウイルス(Hemmagglutinating Virus of Japan:HVJ)の細胞膜融合能に着目して開発されたHVJ-リポソーム法について、これを2種のCF患者由来ヒト気道上皮細胞株および正常マウス肺に適用し、本遺伝子導入法のCF治療における可能性に関する初期的な検討を行った。

　HVJ-リポソーム法は、紫外線照射により生物学的に不活化したHVJウィルスのカプシドを中性脂質リポソームにコーティングすることにより、リポソームに細胞膜融合能を賦与し、リポソーム内に封入したDNAをはじめとするマクロ分子の標的細胞への導入を実現する方法である。発現プラスミドベクターDNAの導入に際しては、DNAの核内移行促進作用が報告されている核蛋白質HMG-1(High mobility group 1)を併用した。

　本研究では、まず本法のヒト気道上皮CF細胞株、CFNPE(変異未同定)およびCFPEo-(△F508)における遺伝子導入効率を評価するため、大腸菌-galactosidaseを発現するプラスミドベクターpSV-LacZを用いた検討を行った。2種のCF細胞株に対してHVJ-リポソーム法(HMG-1併用、以下特記なき場合は同様)は、等量以上のpSV-LacZDNAを陽性脂質リポソーム法(Lipofectin,Gibco BRL)にて導入した場合と比較し、約4-5倍の-galactosidase活性を発現した。この際、全細胞における遺伝子導入細胞の割合はおよそ15-25%であった。

　続いて、HVJ-リポソーム法による、野生型CFTRのCF細胞株における発現を検討した。

　まず4.7kb CFTR cDNAをpSRプロモーター下流に挿入し、CFTR発現ベクターpSR-CFTRを得た。本ベクターをHVJ-リポソーム法にて導入後、標的細胞より調整した高分子DNA試料をSouthern法で解析、CFTR cDNAの導入を確認した。また、標的細胞より調整した全RNA試料をNorthern法により解析したところ、HVJ-リポソーム法ではHMG-1併用時に陽性脂質リポソーム法と比較して有意に高いCFTR mRNAを検出したが、HMG-1非併用時のHVJ-リポソーム法によるCFTR mRNA量は著しく低下した。

　次に、pSR-CFTRのHVJ-リポソーム法による導入にて、cAMP依存性Cl^-コンダクタンスに変化が生じるかを¹²⁵Iを用いた陰イオン流出率測定実験にて評価した。細胞外液に3種のCFTRアゴニスト(200MCPT-cAMP,10M forskolin,1mM isobutylmethylxanthine)を加えたのちの流出率増加を検討したところ、pSR-CFTR導入群は両CF細胞において3-4%/分の流出率増加が認められ、非導入群に対して有意に高値であった。

　最後にHVJ-リポソームの肺内投与における有効性の検討を、非CFマウス(C57BL/6)を用いて行った。pSV-LacZをHVJ-リポソーム法にてマウス気管内より注入し、48時間後に両側肺を摘出、細胞ホモジェネート中の-galactosidase活性を測定したところ、pSV-LacZ投与群では非投与対照群に比較して有意に高値を示した。但し、非投与群においても内因性と考えられる比較的高い-galactosidase活性が認められ、その有効性に関しては定性的な評価が許されるにとどまった。

　以上、HVJ-リポソーム法はヒト気道上皮由来CF細胞株2種において陽性脂質リポソーム法に勝る遺伝子導入効率を示し、さらに野生型CFTRの発現によりCFTRの司るcAMP依存性CTコンダクタンスの部分的回復が可能であった。また非CFマウス肺への投与では、定性的に遺伝子導入能が認められた。本法のCF遺伝子治療への適用可能性は、今後ヒト初代培養気道上皮細胞、CFTR標的破壊マウスを用いた検討、加えて霊長類動物を用いた安全性の検討等によりさらに評価される必要がある。

　本研究はコーカサス人種に高頻度に認められる致死性の遺伝疾患である嚢胞性繊維腫症(Cystic fibrosis,CF)について、各種治療法の適用にも係わらず患者の平均生存年数が改善されていない昨今の状況を踏まえ、CF患者の生命予後を最も大きく左右する要因である慢性呼吸器感染症に対し、薬理学的手法と遺伝子治療の2つの異なる方法論による新しい治療可能性の考察を行ったものである。

　第1部は、Ca²⁺-ATPase阻害剤2,5-di-(tert-butyl)-1,4-hydroquinone(DBHQ)を用いて、CFの責任遺伝子産物Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator(CFTR)にCF患者で最も多く認められる変異(△F508)をもつヒト上皮性細胞(CFPAC-1)において、Ca²⁺依存性Cl^-分泌機構を活性化しCl^-分泌を誘導する手法の可能性を考察したものであり、下記の結果を得ている。

　1.CFPAC-1を用いた陰イオン流出率測定実験の結果、DBHQは有意に¹²⁵I流出率を増加させ、Cl^-コンダクタンスを誘導し得ることを間接的に証明した。その効果はDBHQを細胞外液に加えて2分以内に惹起され、用量依存的であって、25M付近で極大であることを示した。

　2.Ca²⁺感受性色素をCFPAC-1の細胞質内に導入後、DBHQを加えてスペクトロフォトメトリーを行った結果、用量依存的に細胞質内Ca²⁺濃度([Ca²⁺]_i)の持続的上昇が観察されることを示した。この効果は細胞外液中のCa²⁺をキレートすることにより、また細胞膜上のCa²⁺チャネルを阻害するNi²⁺(5mM)の細胞外液への添加により一過性かつ小規模な[Ca²⁺]_i上昇となることを示し、DBHQによる[Ca²⁺]_i上昇には、ミクロソーム膜状のCa²⁺-ATPase阻害効果のみならず、これによって誘起されるCa²⁺influxが寄与していることを示した。

　3.CFPAC-1の全細胞Cl^-チャネルコンダクタンスをpatch clamp法により測定した結果、DBHQの細胞外液への添加はこれを持続的に上昇させることを示した。この際に誘起されるCl^-チャネルコンダクタンスの電気生理学的プロファイルは、外向き整流性かつ時間依存性を示し、Ca²⁺/カルモジュリン依存性Cl^-チャネルの示す特徴と一致することを示した。また、このコンダクタンスは細胞質内へのCa²⁺キレート剤BAPTA(5mM)の添加ないし多機能性Ca²⁺/カルモジュリン依存性蛋白リン酸化酵素CaMKIIの阻害性ペプチド(CaMK[273-302],20mM)の添加により消失することを示した。

　4.細胞外液へのDBHQ添加後に調製したCFPAC-1の細胞ホモジェネートは、Ca²⁺依存性/自律性CaMKII活性の有意な上昇を示し、上記各項の結果と合わせて、DBHQはCaMKII活性化を介したCa²⁺依存性Cl^-チャネルコンダクタンスを誘導し得ることを示した。

　5.また、DBHQへの長期的な暴露による細胞毒性および動物毒性の検討は実験上の制約から実施できなかったものの、短期的細胞毒性に関しては可溶限度近辺の濃度50MまでのDBHQへの6時間の曝露によっても、曝露後のCFPAC-1の生存細胞数、および曝露開始後48時間までの細胞増殖能に有意な変化は認められないことを示した。

　これらの結果から、選択的ミクロソームCa²⁺-ATPase阻害剤DBHQは、ヒトCF上皮細胞においてCaMKII依存性にCl^-イオンの細胞外分泌を促進し得ることが示され、CFTRの変異に伴うcAMP依存性Cl^-コンダクタンスの喪失を補い得る可能性が示された。

　第2部は、センダイウイルス(Hemmagglutinating Virus of Japan:HVJ)の細胞膜融合能を利用した遺伝子導入法であるHVJ-リポソーム法について、これを2種のCF細胞株および正常マウス肺に適用し、そのCF遺伝子治療における適用可能性に関して検討を行ったものであり、下記の結果を得ている。

　6.2種類の異なるCF患者由来ヒト気道上皮細胞株(CFNPE:変異未同定、およびCFPEo-:△F508)に対し、E.coli -galactosidase発現プラスミド(pSV-LacZ)を用いてDNA導入効率を比較した結果、核蛋白質HMG-1を併用したHVJ-リポソーム法は従来の陽性脂質リポソーム法と比較して約4倍以上の-galactosidase活性を発現すること、また全細胞におけるLacZ発現細胞の割合は15%から25%であり、同条件で比較した場合の陽性脂質リポソーム法より高率であることを示した。

　7.CFTR cDNAをpSRプロモーター下流に挿入したCFTR発現プラスミドベクター(pSR-CFTR)を用いて、HVJ-リポソーム法によるCFTR遺伝子のヒトCF細胞株における導入および転写を検討した。Southern分析では、2種の細胞株のいずれにおいても明瞭なCFTR cDNAの細胞内導入が確認されることを示した。またNorthern分析により、陽性脂質リポソーム法と比較して有意に高いCFTR mRNA量がHMG-1併用により発現すること、HMG-1非併用時にはこの効率が著しく低下することを、2種のCF細胞株のいずれにおいても確認した。

　8.pSR-CFTRをHVJ-リポソーム法により2種のCF細胞株に導入した結果、陰イオン流出率測定実験においてcAMPアゴニスト(CPT-cAMP、forskolinおよびIBMX)依存性に¹²⁵I流出率の有意な増加が認められ、この系においてcAMP依存性Cl^-コンダクタンスが部分的に回復されたことを間接的に示した。

　9.非CFマウス(C57BL/6)を用い、HVJ-リポソーム法によりpSV-LacZを気管内より注入したところ、48時間後の両側肺ホモジェネート中に対照群と比較して有意に高値の-galactosidase活性を認め、HVJ-リポソーム法による肺組織へのin vivoにおける遺伝子導入の有効性を定性的に示した。

　これらの結果から、HVJ-リポソーム法はヒト気道上皮由来の異なるCF細胞株2種に対して従来の陽性脂質リポソーム法に勝る遺伝子導入効率を示し、またCFTRの変異によりこれらで失われているcAMP依存性Cl^-コンダクタンスを部分的に回復できること、さらに非CFマウス肺へのin vivo投与により定性的にではあるが遺伝子導入能をもつことが示された。

　以上、本論文は根治的治療法を欠くCFについて、患者の予後を規定する慢性呼吸器感染症増悪の主因が気道内腔へのCl^-分泌不全である場合に、cAMP依存性(CFTR依存性)Cl^-分泌経路の代替としてCa²⁺依存性Cl^-分泌経路のDBHQによる活性化が臨床的に適用できる可能性を示し、また一方で、Cl^-コンダクタンスを含むCFTRの全機能の回復が予後改善に必須である場合に、HVJ-リポソーム法による遺伝子治療の基礎的な可能性を示したものである。

　抗生剤による肺感染症制御を主とする従来のCF治療に限界が認識されつつある現在、DBHQを用いた薬理学的手法により病態が改善できる可能性を示し、またアデノウイルスや従来型リポソームによる遺伝子治療の臨床的試みが初期の段階で困難に直面している中、気道上皮に対する新たな遺伝子導入手法HVJ-リポソーム法の適用可能性を示した本研究は、CF患者の予後改善を指向する基礎研究に重要な示唆を含むものであり、学位の授与に値するものと考えられる。

　なお本論文の共著者4名のうち、A.C.Chaoは第1部の研究に関して学位申請者に立案段階より協力したものであるが、他の3名は実験の一部を分担したのみであり、第2部は学位申請者が単独で実施したものであることを付記する。