女性ホルモンであるエストロゲンは、子宮などの生殖器官や乳腺の発達、機能の維持に重要な役割を果たしている。近年、脳組織、骨組織や血管組織などもエストロゲンの標的器官としてとらえられている。

　閉経後女性におけるエストロゲンの欠乏は骨代謝回転を亢進させ、骨量の減少をもたらす、エストロゲン補充療法は骨量減少の予防及び治療において有意な効果があるなど、エストロゲンが骨代謝において果たす役割の重要性は様々な点から示唆されている。

　骨組織におけるエストロゲンの作用機構については、骨以外の組織を介する間接的なものとされてきた。しかしながら、最近の研究では、骨形成をつかさどる骨芽細胞、骨吸収をつかさどる破骨細胞においてエストロゲン受容体(ER)の存在が確認され、エストロゲンは骨の細胞に直接作用するものと考えられている。骨を含めた多様な標的器官に対して、エストロゲンの作用が一様であるのか、さらには、個体のレベルで、エストロゲンに対する反応性やエストロゲン欠乏状態に対する適応に多様性があるのか、これらについては、分子生物学的に解明されなければならない。

　ERには通常のER以外に、いくつかのsplicing variants(アイソフォーム)が存在することが、乳癌組織に関して報告されている。これらのアイソフォームの機能については不明な点が多いが、その中には正常なERの働きを抑制するdominant negativeな作用を持つものも報告されている。一方、正常組織においては、脳組織、および血管組織におけるERアイソフォームの報告があるが、骨組織におけるアイソフォームについては報告がない。

　そこで、本研究では、まず、骨におけるERアイソフォームの存在およびその機能について検討した。

　さて、骨粗鬆症は、骨塩量が病的に減少した結果、骨の微細構造が破綻し、易骨折性が増大する疾患である。骨粗鬆症は遺伝的素因と環境的因子がそれぞれ複雑に関与する多因子性疾患と考えられている。遺伝的素因に対する分子生物学的アプローチとして、1994年、MorrisonらがビタミンDレセプター遺伝子のRestriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)が骨量の有用な遺伝的マーカーとなりうることを報告した。しかしながら、他のグループによる追試では、骨量に差は認めなかったとの報告もあり、骨粗鬆症における遺伝的素因はいまだ検討が必要な領域である。

　エストロゲンの骨代謝における重要性から、ER遺伝子が骨粗鬆症の原因候補遺伝子の一つである可能性は高い。また、ER遺伝子には突然変異を含めて、いくつかの遺伝子多型性(polymorphism)が報告されている。このような分子多様性と、婦人科領域の臨床像との間に関連性があることが示唆されている。また、Kobayashiらは、イントロン1内のRFLP(PvuII,XbaI)でgenotypeを分類した場合、特定のgenotypeを持つ閉経後女性の群が、他のgenotypeと比べて、骨塩量が低いことを報告している。このように、ER遺伝子の多型性として、non-coding regionの多型性については報告があり、いくつかの臨床的意義が検討されてきたがエクソン内の遺伝子多型性に関する報告はほとんどない。

　そこで、本研究においては、ER遺伝子のエクソンに遺伝子多型性を求め、Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformational Polymorphism(PCR-SSCP)法を用いて検討した。

　本研究では、骨代謝の立場から、エストロゲン受容体(ER)の多様性についてmRNAレベルおよびDNAレベルで解析した。骨組織および培養骨芽細胞において検出された△4アイソフォーム、△3/4アイソフォームのうち、△4アイソフォームは1993年にSkipperらにより正常な脳組織に存在することが報告されたものであるが、△3/4アイソフォームは今回、初めて見いだされたものである。△4アイソフォーム、△3/4アイソフォームはDNA結合部位とともにリガンド結合部位の一部をも欠失するものである。従って、これらのアイソフォームは、エストロゲン依存性転写活性を失っていることが予想された。in vitro transient expressionの系を用いて、これらのアイソフォームが、実際にエストロゲン依存性転写活性を失っていることを本研究で示した。このように機能を持たないERの組織での発現量が増加することが、エストロゲンに対する応答性の低下に結びつく可能性がある。 ERアイソフォーム発現の臓器特異性や病態による差異、加齢に伴う変化などについて今後検討すべきである。

　一方、ERのエクソン内の多型性の有無についてPCR-SSCPを用いて、検討したところ、エクソン4内の975番目の塩基であるシトシン(C)がグアニン(G)に1塩基置換を起こしているalleleの存在が確認された。各genotypeと骨塩量や各種骨代謝マーカーの関連について検討したところ、尿中カルシウム排泄量の多いMM群は、mm群と比べて骨塩量の減少率が速い傾向にあることがわかった。閉経直後の女性は尿中カルシウム排泄量が多く、エストロゲン補充療法により、尿中カルシウム排泄量が減少するという報告もあり、新たなエストロゲン受容体遺伝子の多型性が影響を及ぼしている可能性がある。この塩基置換はsilent mutationであったが、ERのエクソン内の多型性については高血圧や自然流産の発症頻度との関連性が示唆されているエクソン1の突然変異(silent mutation)以外には現在までに報告はなく、エクソン内に新たな多型性を検出した本研究の意義は大きいと考える。

　なお、すでに、骨塩量と関連性があることが報告されているERイントロン1内のRFLPとの関連を検討した。特に骨塩量が低いと報告されたPPxxというgenotypeを持つ群の中での、MMというgenotypeを持つものの出現頻度を調べたところ、統計学的に予想される出現頻度より、高い頻度で出現することが²乗検定を用いて示された。このことから、イントロン内の遺伝子多型性が連鎖不均衡にある可能性が示唆された。

　本研究で見い出された新たな多型性は臨床像の解析に応用される可能性の他に、ポジショナルクローニングや連鎖解析などの手法を用いた、病因遺伝子の究明に有用な遺伝子マーカーとして用いられる可能性もあり、今後の研究が待たれる。