シスプラチン(cDDP)は現在,婦人科癌を含む固形癌に対して最も使用されている抗癌剤のひとつであるが,初回治療時からcDDPが効かない症例や治療中に効かなくなる症例は臨床上しばしば経験される.cDDP耐性の機序およびその克服に関する研究は婦人科癌治療の大きな課題といえる.cDDP耐性機序のなかでも,細胞内還元物質であるグルタチオンの関与については多数報告されている.チオレドキシン(TRX)はredox-activeなSH基をもつ分子量13,000の蛋白質で,活性酸素種消去作用や変性した蛋白質のrefolding作用を有しており,グルタチオンと同様に細胞内で酸化ストレスからの防御に寄与していると考えられている.実際,過酸化水素・tumor necrosis factor(TNF)あるいは虚血再環流による細胞傷害に対してTRXが防御作用を示すことはすでに報告されている.私は,グルタチオンと同様の作用を持つTRXがcDDPによる細胞毒性に対する防御作用すなわちcDDP耐性に関与しているとの仮説をたて,cDDP耐性細胞におけるTRXの発現およびTRX高発現細胞におけるcDDP耐性度を検討した.

　1)cDDP耐性細胞St/DDP,HT/DDPは親株St-4,HT-29と比較してそれぞれ7倍,5倍cDDPに耐性を示した.復帰変異株St/R6,St/R12は親株に比べ3.4倍,1.6倍耐性であった.これらの細胞のTRX発現量はcDDP耐性度に比例して増加していた(図1).

　また11種類の卵巣癌細胞株においてcDDP耐性度とTRX発現量との間の強い正の相関を認めた.(図2).

図1.cDDP耐性細胞のTRX発現1,St-4;2,St/DDP,3,St/R6;4,St/R12;5,HT-29;6,HT/DDP

図2.卵巣癌細胞におけるcDDP耐性とTRX発現の相関

　2)図3に示すようにA2780,HT-29に由来するTRX高発現細胞が得られた.

図3.TRXトランスフェクタントのTRX発現A;A2780由来細胞1,A/01;2,A/07;3,A/TRX12;4,A/TRX19B;HT-29由来細胞1,HT-29T9;2,HT/AS11;3,HT/AS13;4,HT/TRX10;5,HT/TRX25;6,HT/TRX28;7,HT/TRX34;8,HT/TRX62;9,HT/DDP

　これらの細胞ではTRXの酵素活性も発現量に比例して上昇しており,A/TRX12,A/TRX19では親株の1.8倍,HT/TRX25では親株の2.1倍,HT/TRX28では2.9倍の活性を示した.HT/TRX28ではHT/DDPよりも高いTRXの発現量・酵素活性を示した.さらにこれらの細胞でベクター由来のTRX遺伝子の組み込み・mRNA発現も確認できた.

　これらのTRX高発現細胞は2種類の感受性試験のいずれにおいてもcDDPに耐性を示さなかった(図4,5).A2780由来のTRX高発現細胞は過酸化水素に耐性を示したが,アドリアマイシン,カンプトテシン,マイトマイシンCには耐性にならなかった.またHT-29由来のTRX高発現細胞は過酸化水素にも3種の抗癌剤にも耐性を示さなかった.

図4.MTT assayによるTRXトランスフェクタントのcDDP感受性(A)A2780由来細胞□,A/01;○,A/07;■,A/TRX12;●,A/TRX19(B)HT-29由来細胞△,HT-29T9;□,HT/AS11;○,HT/AS13;■,HT/TRX25;●,HT/TRX28;▲,HT/DDP.

図5.コロニー形成法によるTRXトランスフェクタントのcDDP感受性(A)A2780由来細胞□,A/01;■,A/TRX12;●,A/TRX19(B)HT-29由来細胞□,HT/AS11;■,HT/TRX25;●,HT/TRX28

　本研究においてin vitroで樹立した2種類のcDDP耐性細胞でTRXの発現の亢進を認めた.Yokomizoらも3種類のcDDP耐性細胞でTRXの過剰発現を報告している.また本研究ではin vitroでcDDP処理をしていない細胞株においてもcDDP耐性とTRXの発現量との間に正の相関を認めた.このことはTRXの過剰発現がcDDP処理により生じたのではなく,cDDP耐性形質そのものに伴っていることを示している.さらにYokomizoらはTRXのアンチセンスベクターを導入してTRX発現を下げたヒト膀胱癌T24細胞でcDDP感受性化を報告し,最近ではSasadaらがヒトTRX遺伝子を導入したマウス線維肉腫L929細胞でcDDP耐性化を報告している.これらの事実はTRXがcDDP耐性に関与していることを強く示唆している.

　それに対し,本研究で樹立した2種類のTRX高発現細胞はcDDPに耐性とならなかった.これはTRXが単独でcDDP耐性を誘導したSasadaらの研究結果と相反しており興味深い.いずれの研究でもTRXの発現は親株の2〜3倍であることから,結果の違いはTRXを導入した細胞の違いによるものと考えられる.

　cDDPが細胞内で活性酸素種を発生させること,cDDP毒性が抗酸化薬で抑制されることから,活性酸素種がcDDPの細胞毒性の一部を担っていると考えられる.活性酸素種はアポトーシスのメディエーターのひとつであるので,抗酸化薬はアポトーシスを抑制することでcDDP毒性を抑えている可能性がある.Sasadaらの研究で用いられたL929細胞はTNFや抗癌剤によりアポトーシスを起こし,抗酸化剤によりアポトーシスが抑制されることが報告されている.そのような細胞で活性酸素種消去作用をもつTRXがcDDP耐性を誘導しており,アポトーシス抑制作用を介したcDDP耐性機序が想定される.しかし活性酸素種の毒性やアポトーシスによる細胞死の機序のみでcDDPの細胞毒性を説明しつくせるものではない.本研究で用いたA2780,HT-29細胞は抗癌剤によるアポトーシスを起こしにくい細胞であり,研究で用いた濃度のcDDPで細胞死は起こすが,アポトーシスに特徴的な変化は認められない.従ってTRXが活性酸素種を消去し,アポトーシスを抑制したとしても,それ以外の機序で細胞死が起こるためにcDDP耐性が認められなかったと説明できる.このような細胞のアポトーシスの起こしやすさの違いがTRXによるcDDP耐性の誘導の違いに影響していると考えられる.

　TRXは上述のように活性酸素種消去作用やアポトーシス抑制作用を介してcDDP耐性に関与している可能性のほかに,転写因子のredox-regulationによる遺伝子発現調節作用,DNA修復酵素など薬剤耐性の直接の原因となる蛋白質の安定化作用により耐性に寄与している可能性も考えられる.