東京大学病院及び帝京大学病院において治療された骨肉腫患者26名よりの生検時組織標本を用いた。全ての標本は本研究使用まで摂氏-80度に凍結保存された。

　凍結組織標本をRIPA bufferで可溶化し、各標本の可溶化液を7.5%SDS-ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した。ゲル上の蛋白質をニトロセルロースフィルターに電気的にトランスファーし抗ErbB-2抗体でブロットした。

　ホルマリンまたはパラフィン固定組織標本切片をStreptoavidin-biotin-peroxidase法を用いて染色した。抗体はウエスタンブロッティングと同様のものを用いた。

　腫瘍組織よりフェノール抽出法を用いてゲノムDNAを調製した。EcoRIで切断し、アガロースゲルに電気泳動後、フィルターにトランスファーし、ヒトc-erbB-2全長のcDNAをプローブとして用いてサザンブロッティングを行った。DNA量のコントロールとしてヒトアクチンcDNAをプローブとして用いた。

　c-erbB-2遺伝子膜貫通部位の変異を検出するためにPCR-SSCP法を用いた。膜貫通部位を増幅するようなPCRプライマーを作成し、PCRを30サイクル行った。その反応液をグリセロール加非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。オートラジオグラフィーを行い、検出した異常バンドをゲルより切り出しシークエンスを行った。

　患者の生存率はKaplan-Meier life table methodを用いた。臨床データとErbB-2蛋白質発現の関連は、カイ二乗検定を用いて評価した。

　ウエスタンブロッティングにより26症例中11例の組織(42%)にErbB-2蛋白質の発現を認めた。得られたバンドは185kDで欠失したErbB-2蛋白質は認めなかった。ウエスタンブロッティング陽性10例と陰性8例について免疫組織化学染色を行ったところ、ウエスタンブロッティングと免疫組織化学染色におけるErbB-2蛋白質発現の有無は一致した。

　ウエスタンブロッティングによるErbB-2蛋白質陽性11例に、c-erbB-2遺伝子の著明な増幅や著明な変異は認められなかった。

　ErbB-2蛋白質を活性化させるような変異は存在しなかった。

　ウエスタンブロッティングでのErbB-2陽性群の生存率は陰性群に比べて有意に低かった(P<0.01)。さらに、ErbB-2蛋白質の発現と肺転移との関連も認められた(P<0.05)。ErbB-2蛋白質陽性症例では術前化学療法無効例が多かった(P<0.01)。

　tobの各種変異を導入したcDNAを、SRをプロモーターとするpME18S発現ベクターに組み込んだ(Fig.1)。

　各発現プラスミドはHEK293T細胞にリン酸カルシウム法でトランスフェクションし、ウエスタンブロッティングを行い、細胞内での発現を確認した。

　NIH3T3細胞に各発現プラスミドとpRSVneoを20:1の量でトランスフェクションした。48時間経過後G418含有培地に交換しセレクションを始めた。2週間後、プレートのまま細胞を固定し、ギムザ染色液で染色した。

　NIH3T3細胞を0.1%Calf Serum加DMEMで24時間インキュベートする。その後、pMEGFPと各種発現プラスミドを共にマイクロインジェクションする。さらに、マイクロインジェクション前と同条件で24時間インキュベートした後10%Calf Serum・BrdU・DMEMに換えた。この条件で18時間インキュベート後、ホルマリン固定し、抗BrdU抗体で免疫蛍光染色を行った。GFP発光細胞を最低120個以上計数し、(BrdU陽性細胞数)/(GFP発光細胞数)を求めた。

　Tob各種変異体のcDNAフラグメントをpGEX-3Xベクターに導入しGST融合蛋白質の発現プラスミドを構築した。このプラスミドを大腸菌にトランスフォーメイションし、蛋白質作成の誘導を行った。大腸菌液を超音波破砕し、グルタチオンアガロースにGST融合蛋白質を吸着させた。

　Jurkat細胞をRIPA bufferで可溶化後、グルタチオンアガロースビーズに固定したGST-Tob変異体融合蛋白質2gと摂氏4度で150分間穏やかに混合した。RIPA bufferで5回洗浄し結合蛋白質をSDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、フィルターにトランスファーし、各種抗体(Cdk)でブロットした。

　Wild typeのTob発現プラスミドでは、コントロールの発現プラスミドに比ベネオマイシン耐性コロニーは極めて少数しかできなかった

　Tobは細胞増殖を負に制御する機能を有することよりTobが細胞周期をある特定の時期で止める可能性が考えられる。細胞周期G0/G1-S期の進行へのTob発現プラスミドの効果を調べるために、血清飢餓状態のNIH3T3細胞にTob発現プラスミド並びにGFP発現プラスミドをマイクロインジェクションで導入した。その結果、TobがG0/G1-S期への細胞周期の進行をブロックする機能を持つことが示唆された。また、各種変異体プラスミドのマイクロインジェクションにより、Tobの1-103アミノ酸領域と104-163アミノ酸領域に細胞周期の進行を阻止する機能があることが示された。

　GST-Tob融合蛋白質はCdk2,Cdk4,Cdk6と結合特性を持つことが示された。また、in vitroではTobの1-103アミノ酸領域で各種Cdkと結合特性を持つことが示された。

　我々の研究室ではTobとhCAF1とが相互作用することが確認されている。GST-Tob融合蛋白質を用いてhCAF1との結合特性を調べたところTobの104-163アミノ酸領域と結合することが示された。