ヘパリンアフィニティーカラムにより、非吸着画分、Hep-0.5Mおよび1.2M NaClで溶出する画分(Hep-1.2M)の3画分を得た。Hep-0.5Mはマウス脾臓から得たblast cellの破骨細胞様多核細胞への分化を促進したので、この画分のどこにこのような作用があるかを検討するため、Hep-0.5MをC4逆相HPLCによりさらに19個の蛋白質ピークに分画した。これら19画分の破骨細胞形成に対する作用を、凍結融解したマウス未分画全骨細胞を使って検討した。破骨細胞形成促進活性の見られた第5ピークをさらにC8逆相HPLCにより分画し、最終精製物(C₈-4)を得た。そのN末端アミノ酸配列は、AQDDYRYIHFLTQHYDAKPKGRNDEYXPNMであった。27残基目のアミノ酸は検出されなかったが、その他はbovine angiogeninのN末端アミノ酸配列に一致した。Angiogeninは血管新生作用を持つことが知られている蛋白質である。

　凍結融解したマウス未分画全骨細胞にC₈-4を添加して培養すると、C₈-4は10ng/mlをピークとして用量依存的に破骨細胞形成を促進した。そこで化学合成human angiogeninを用いて同様に検定したところ、C₈-4と同等の活性を持っていた。したがって骨端軟骨中にはangiogeninが存在し、破骨細胞形成促進活性を持っていることが明らかになった。

　成熟破骨細胞に対する活性は、ウサギ末分画全骨細胞を培養した場合、精製bovine angiogenin(C₈-4)と合成human angiogeninとは用量依存的に骨吸収を促進した。しかし、破骨細胞のみを単離して培養した場合には骨吸収促進活性は見られなかった。したがってangiogeninは破骨細胞以外の細胞を介して間接的に破骨細胞の骨吸収を促進すると考えられた。

　Angiogeninは破骨細胞の形成と破骨細胞による骨吸収とを促進した。Angiogeninによる骨吸収促進作用によって軟骨・骨基質は溶解し、新たに骨基質を蓄積する空間と骨髄の空間を作り出していくと考えられた。Angiogeninには血管新生作用があることも知られており、血管侵入を促進するという点でも内軟骨骨化の進展に寄与していると推定される。

　Hep-0.5MとHep-1.2MとはMC3T3-E1のDNA合成を促進する一方で、ALP活性を抑制した。Hep-1.2M中にはChM-Iが、Hep-0.5M中にはChM-IIが存在することが報告されている。ChM-IとChM-IIとは濃度依存的にMC3T3-E1の細胞数とDNA合成とを増加させた。またChM-IとChM-IIとは濃度依存的にMC3T3-E1のALP活性を抑制した。初代培養骨芽細胞に対しても、ChM-IとChM-IIとはDNA合成を促進し、ALP活性を抑制した。したがって、生体内においてChM-IとChM-IIとは骨芽細胞の分化を抑制したまま増殖を促進し、その消失により骨芽細胞の分化が進展するといった作用機序が考えられた。ChM-I、ChM-IIの軟骨細胞のDNA合成を促進する作用は、basic fibroblast growth factorが存在すると相乗的に強くなることが知られているが、MC3T3-E1に対しては相加的な促進作用が見られ、細胞によりChM-IおよびChM-IIの作用発現機序が異なる可能性が示唆された。