(1)動物の免疫:ウシ眼球より網膜色素上皮細胞(RPE)を採取し、PBSに浮遊させた細胞浮遊液(1x10⁷ cells)を生後8週齢のBALB/cマウスに腹腔内投与した。

　(2)細胞融合:尾静脈血清で抗体価の上昇を確認したマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞(Ag8.653)をポリエチレングリコールを用いて細胞融合させハイブリドーマを作成した。スクリーニングには、ハイブリドーマの培養上清を用い、ウシ網膜凍結切片の免疫組織化学的染色を行い、RPEおよび神経網膜の染色パターンにより本研究の目的にかなう抗体を選択し、限界希釈法にてクローニングをおこなった。

　(3)腹水の調製:クローニングしたハイブリドーマを、成熟BALB/cマウスに腹腔内投与し、腹部の顕著な肥大が認められたのち、腹水を採取した。

　(4)抗体の精製:得られた腹水から、Protein Gアフィニティーカラムを用いてモノクローナル抗体を精製し以後の実験に使用した。

　組織を4%Formaldehydeを含むリン酸緩衝液で固定後、凍結切片を作製し、1次抗体(Hybridoma培養上清、および精製モノクローナル抗体)及びFITC標識2次抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。

　ウシ網膜をアルデヒド固定液(0.1%Glutaraldehydeおよび4%Formaldehydeを含むリン酸緩衝液)で固定後、ビブラトームで40m厚切片を作製し、0.05%サポニン処理後、精製モノクローナル抗体及びHRP標識2次抗体と反応させた。さらに1%Glutaraldehydeを含むリン酸緩衝液で再固定し、ジアミノベンチジン(DAB)反応を行い、オスミウム固定後、アルコール系列で脱水し、エポン樹脂に包埋、超薄切片を作製し、透過型電顕(JEOL1200EX)で観察した。

　ウシ眼球より採取した神経網膜およびRPEを、0.32M Sucrose、3mM MgCl₂、3mM EGTAおよびProtease Inhibitorを含むTris緩衝液中でホモジナイズした後、10%SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動しメンブレンに転写した。メンブレンはモノクローナル抗体、アルカリフォスファターゼ標識2次抗体と反応させ、BCIP/NBTを基質に用い発色させた。

　(1)cDNAライブラリーの作製とImmunological Screening:ウシ網膜および脈絡膜よりAGPC法(acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform method)によりTotal RNAを、Oligo(dT)Sepharoseを用いてPoly(A)⁺RNA、更にcDNAを調製し、発現ベクターgt11に組み込みcDNAライブラリーを作製した。Immunoscreeningは精製モノクローナル抗体を用い常法に従って行い、陽性クローンをpBleuscriptベクターにサブクローニングしA.L.F.DNA Sequencer II(Pharmacia)を用いてジデオキシ法により塩基配列を決定した。

　(2)ノーザンブロット解析:組織から得られたTotal RNA10gを1%アガロースゲルに電気泳動した後メンブレンに転写し、³²PラベルしたRPE7cDNAフラグメント(BamHI-BamHI fragment)をプローブに用いHybridyzeさせた。

　RPE7 cDNAのOpen Reading FrameをPCRで増幅し、発現ベクターpcDNINeoに組み込み、エレクトロポレーション法を用いてCOS-7細胞に発現させた。3日間培養後、ホルムアルデヒド溶液で固定し、抗RPE7 モノクローナル抗体、FITC標識2次抗体を用いた蛍光抗体法で蛋白発現を確認した。

　ウシ眼球よりトリプシン処理によりRPEを採取し、10%FCSを含むダルベッコ改変培地(DMEM)で培養し、蛍光抗体法にて抗原の発現を確認した。ゼラチンザイモグラフィーは、その培養上清をゼラチンを基質に含むSDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ca²⁺、Zn²⁺存在下で反応させメタロプロテアーゼの活性を調べた。

　得られた数種類のモノクローナル抗体は、ウシ網膜凍結切片の蛍光抗体法(間接法)では様々な染色パターンを呈した。RPEでは、細胞膜を認識するもの、細胞質を認識するもの、さらには神経網膜も染色するような数種類のモノクローナル抗体が得られた。そのうち、RPE細胞表面と、神経網膜のなかでも特に支持細胞であるミュラー細胞と思われる部位を強く染色するような抗体、抗RPE7抗体を選択し、その抗原蛋白RPE7について解析を行った。

　抗RPE7抗体は、RPEおよび神経網膜において分子量40-50キロダルトンの幅広いバンドを認識した。このような幅広いバンドの出現は糖鎖の結合によるものと考えられる。

　ウシ網膜を用いた免疫電顕で、RPEおよびミュラー細胞膜表面にDAB反応産物がみられた。抗RPE7抗体を用いた蛍光抗体法でみられた神経網膜の染色は、ミュラー細胞表面に由来することが確認された。

　種特異性を網膜凍結切片で調べたところ、抗RPE7抗体は、ウシ以外にはブタで陽性、ニワトリ、マウス、カエルに陰性であった。また、臓器特異性をウシの他臓器で調べたところ、尿細管上皮細胞膜および大腸吸収上皮細胞膜を認識した。

　Immunoscreeningにより得たRPE7cDNAは、ノーザンブロットで1.8kbのmRNAを認識した。予想されるアミノ酸配列より、ウシRPE7は271アミノ酸からなる免疫グロブリン様領域をもった膜貫通蛋白質で、ある種の蛋白質群のSpecies Homologueであることがわかった。この蛋白質群には、HT7(ニワトリ)、basigin(マウス)、OX-47(ラット)、M6(ヒト)、EMMPRIN(ヒト)などが含まれ、これらは血液脳関門を形成する血管内皮細胞や活性化リンパ球、癌細胞などの膜表面に存在する糖蛋白質であるが、それぞれの蛋白質の機能解析は充分に行われているとは言い難い。

　上記蛋白質群のなかで、EMMPRINは、癌細胞の浸潤、転移に重要な細胞外マトリックスメタロプロテアーゼを誘導する蛋白質としてクローニングされた。そこでウシRPE培養上清中のメタロプロテアーゼ活性を調べたところ、抗RPE7抗体を添加することによりその活性が増強されることがわかった。