8-9週齢雄性Wistar系ラットを、urethane麻酔下に両側椎骨動脈を電気焼灼し、両側総頚動脈に絹糸を掛けた後、脳定位固定装置に固定し貫通線維刺激による歯状回での誘発電位を測定した。虚血による呼吸停止を防ぐため人工呼吸器を使用し、体温は保温マットを用い測定期間中37±1℃に維持した。誘発電位の安定後、両側総頚動脈をクレンメで一過性に閉塞し虚血負荷を与えた。

　ラットをpentobarbital麻酔下に両側椎骨動脈を電気焼灼し、両側総頚動脈に絹糸を掛けた後、傷口を縫合した。24時間絶食後、無麻酔下で両側総頚動脈をクランメで一過性に閉塞し、虚血負荷を与えた。sham群には、クレンメで閉塞する以外の全ての処置を施した。虚血中に正向反射の消失したラットのみを実験に使用した。一定期間後、ラットをurethane麻酔下に脳定位固定装置に固定し、誘発電位を測定した。

　歯状回顆粒細胞層で細胞外記録を行い、誘発電位はpopulation spike amplitude(SA),field EPSP slope(ES),field EPSP duration(ED)をパラメーターとした。長期増強(LTP)、及びpairedpulse facilitation(PPF:一定間隔で2回の刺激を行ったときの1回目の応答に対する2回目の応答の増大率)の測定は、SAの最大反応の50%を誘発する刺激強度で行った。波形は全てデジタル変換し、コンピューターでオフライン解析した。

　測定終了後、ラットを4%paraformaldehyde/0.1M phosphate bufferで灌流固定し脳を摘出した後、凍結切片を作製しNissl染色を施した。

Fig.1 15分虚血3日後における刺激-反応曲線(上段:SA,下段:ES)

　両側総頚動脈を閉塞することにより誘発電位は虚血時間依存的に減弱した。軽度の虚血負荷(1.5-5分)により誘発電位は減弱したが、再灌流10-15分後には虚血前のレベルに回復した。しかし虚血30分後に高頻度刺激(100Hz、1s)を行いLTPを誘発させたところ、sham群と比較して有意な増強率の低下が観察された。このことから、通常のシナプス伝達(誘発電位)よりも可塑性(LTP)の方が虚血による影響を受けやすいことがわかった。虚血負荷2時間後、同様の高頻度刺激を行っても増強率の低下が認められなかったことより、軽度虚血負荷による影響は一過性であると考えられた。一方、強度の虚血負荷(10-15分)により、誘発電位は完全に消失し、再灌流5-15分後に誘発電位が再び記録されたが、虚血後2時間を経ても完全な回復には到らなかった(虚血前のレベルの約70%)。また、虚血3時間後においてもLTPの低下が認められ、強度の虚血負荷による影響は持続的であることが推測された。

　a)誘発電位に対する影響:15分の虚血負荷により、SA、ES共に低下し(Fig.1)、これは2週間にわたって持続した。1カ月後にはSAはsham群のレベルまで回復したがESは依然として低下したままであった。b)LTPに対する影響:15分の虚血負荷により1、3日後におけるLTPの誘発は顕著に阻害された(Fig.2、○vs●)。それに対し虚血負荷1-2週間後におけるLTPの誘発は虚血群の方がSham群よりも増加の傾向を示した。また、虚血1ヶ月後におけるLTPはsham群と同程度の増強率を示した。虚血2、3日後に著しい学習障害が観察されたという報告は今回の結果と一致しており、1-2週間後に認められるLTPの増強には何かしら代償機構が働いている可能性が考えられる。c)PPFに対する影響:15分虚血負荷1、3日後において、SAのPPFは20-200msの刺激間隔で顕著な減少が認められた。また、ESのPPFにおいても20-400msの刺激間隔で明らかなPPFの減少が認められた。これらのことから、虚血により抑制性神経を介するfeedback inhibitionが亢進した可能性が考えられる。この傾向は若干回復をみせるものの1ヶ月後においても認められた。一方、EDのPPFは虚血後1日-1ヶ月にわたり持続的に増大し、この増大はNMDA receptor antagonistであるAPV(50nmol、i.c.v.)により有意に抑制された。このことは、虚血により誘発電位におけるNMDA成分の寄与が大きくなることを示しており、シナプスの可塑性や、興奮毒性の発生に関与する可能性(後述)が示唆された。d)組織化学的変化:15分の虚血負荷により、2-3日後からCA1野錐体細胞の顕著な脱落が認められたが、歯状回顆粒細胞における光学顕微鏡レベルの形態変化は観察されなかった(Fig.3)。以上の結果から、海馬歯状回において神経細胞死が見られないにもかかわらず電気生理学的機能の著しい変容が認められることが明らかになった。

Fig.2 15分虚血によるLTPへの影響およびCNQXの効果(虚血3日後)

　海馬CA1野における虚血性神経細胞死にはglutamate receptorを介した興奮毒性が関与すると言われている。そこで、15分虚血3日後の、海馬歯状回における誘発電位の低下及びLTPの減弱に対する種々の薬物の効果を検討した。AMPA/kainate receptor antagonistであるCNQX(虚血20分前、50nmol、i.c.v.)は、誘発電位の低下には影響を及ぼさなかったが、LTPの減弱を有意に改善させた(Fig.2、▲vs●)。一方、benzodiazepine receptor agonistのdiazepam(虚血20分前及び24時間後、10mg/kg、i.p.)は、LTPの減弱に対し効果を示さなかったが、SA、ESの低下を有意に改善させた。またAPV(虚血25分前、100nmol、i.c.v.)は、誘発電位の低下及びLTPの減弱に対して効果を示さなかった。以上の結果から歯状回における機能変化においても興奮毒性が一部関与していることが明らかになった。また、誘発電位とLTPに対する作用が薬物により異なることから、通常のシナプス伝達とシナプス可塑性に対する虚血障害のメカニズムが異なることが示唆された。

Fig.3 15分虚血3日後における海馬組織切片像

　DG:歯状回