Am80の活性発現にはアミド基の立体が重要な役割をもっていることがわかっている。Am80のアミド基を固定してかさ高い疎水性置換基を導入した化合物であるLE135はレチノイン酸やAm80等のレチノイドのヒト急性前骨髄球性白血病細胞HL-60に対する分化誘導作用を用量依存的に抑えた。このアンタゴニスト活性にはベンゼン環上のアルキル基とカルボキシル基が必要である。LE135の無置換のフェニル基をよりかさ高くすることでアンタゴニスト活性が上昇した(Fig.1)。ただし、その向きや大きさには制限があり、LE540が最も強力な活性を示した(Fig.2)。HeLa細胞に各RARのリガンド結合領域とGAL4のDNA結合領域との融合蛋白(GAL-RARs)を発現させた系においてLE540はLE135よりも強力に9-cis-レチノイン酸によるRARsの転写活性化を抑えた(Fig.3)。これらアンタゴニストの核内レセプターとの親和性を比較すると、大腸菌に発現させた蛋白を用いた結合試験においてLE135はRAR,にしか結合せず、RARにやや選択的である(Table1)。一方LE540はRAR及びRXRの全てのサブタイプに結合したがRAR,へのKi値はLE135とあまり差はなく、HL-60細胞でのアンタゴニスト活性の強さを反映していない。LE540がRXRにも同程度の親和性をもつことから、アンタゴニスト活性にはRXRとの結合を介する効果もあるとみられる。

Fig1

Fig.2 Effect on Am80(3.3×10^-9M)-Induced Differentiation of HL-60 cells

Fig.3 Transactivation Assay of LE135 and LE540Influence of Dibenzodiazepine Derivatives on RAR-Transactivation Induced by 10^-9M 9-cis-Retinoic Acid

Table1

　HX600はLE135のアンタゴニスト活性に重要なアルキル基の位置の異なる構造異性体であり、それ自身ではレチノイド作用を持たない。しかし、Am80と共存させるとそのHL-60細胞の分化誘導作用を著しく増強した(Fig4)。このシナジスト効果はレチノイン酸、Ch55といったレチノイドに対しても認められた。シナジスト活性にもやはり、かさ高いアルキル基とカルボキシル基が必要である。ジアゼピン環を形成するメチルアミノ基を硫黄原子(HX630)やメチレン(HX640)に換えることで更に活性が増強した。HX600類縁体の構造要求性からそのシナジスト作用が核内の特異的レセプターを介していると予想される。単純には、Am80がRARに特異的に結合することから、これらのシナジストがRAR/RXRヘテロダイマーのRXR側に結合することによって活性を増強するメカニズムが考えられる。HeLa細胞での転写活性化においてHX600がGAL-RARsを全く活性化せず、GAL-RXRsを活性化する(Fig5)ことからRXRのリガンドとして機能しうることが示唆された。また、代表的RXR選択的リガンドとして報告されたLGD1069もHL-60分化誘導においてHX630、HX640と同程度にAm80の作用を増強した。しかし、LGDl069がRXRsに対し5.9〜16nMのKi値で結合するのに対し、ジアゼピン類のKi値は400〜1900nMである(Table2)。これは細胞レベルでの作用発現濃度(10^-9〜10^-8M)に比べ予想外に低く、in vitroでのRXRsとの結合能のみからはジアゼピン類のシナジスト作用を説明できず、RAR/RXRヘテロダイマーに特異的に結合すると考えている。

Fig4 Effect on Am80(10^-9.5or10^-9M)-Induced Differentiation of HL-60 cells

Fig.5 Transactivation Assay of Rctinoid Synergist HX600

図表

Table2

　レチノイドシナジストであるHX600の無置換のベンゼン環上にニトロ基を導入したHX531はHL-60検定においてアンタゴニスト活性を示した(Fig.6)。またHX600のイミンを還元してN-メチル化したHX711も同様にアンタゴニスト活性を示した。HX531のRXRsへの結合能はHX600とほぼ同程度であるが、RARに対してはHX600よりも高い、またHX711はRXR,にのみ結合する。(Table3)。HX531,HX711は9-cis-レチノイン酸によるGAL-RXRsの転写活性化を抑制し、RXRアンタゴニストであることが解った。RXRアンタゴニストとしては一例報告があるが、その化合物はRXRホモダイマーに対してはアンタゴニストとなるもののRAR/RXRヘテロダイマーに対してはアゴニストとして作用する。本研究で見出したRXRアンタゴニストHX531,HX711は細胞レベルでの応答からRAR/RXRヘテロダイマーのアンタゴニストであると考えている。

Fig.6

Table3

図表