3-HKが活性酸素を産生する可能性が示唆されていた。そこで、1.で認められた3-HK毒性に酸化ストレスが関与しているかを各種抗酸化剤を用いて検討した。3-HK毒性は、-tocopherol、trolox、N-acetylcysteine、ascorbate、スピントラップ剤TMPO、catalaseによって有意に抑制されたが、superoxide dismutaseによっては阻害されなかった(Fig.2A,B)。また、鉄キレータであるdesferrioxamineは3-HK毒性を有意に阻害した。さらに、細胞内における過酸化水素の産生を証明するために、過酸化物の蛍光指示薬である2’,7’-dichloro-fluorescin diacetate(DCFH-DA)を負荷し、3-HK添加20時間後の線条体神経細胞における過酸化水素の量的変動を共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した。3-HK添加群では、対照群に比べ、細胞内の蛍光強度が約4倍の増加を示し、この増加は、catalaseの共添加により有意に抑制された(Fig.3A)。以上の結果より、3-HK毒性には細胞内における過酸化水素の産生及びそれに基づくhydroxylradicalの誘導が関与していることが明らかとなった。さらに、3-HKの過酸化水素産生機構を解明するために、無細胞系の条件で3-HKの自動酸化の動態をDCFを用いて検討した。3-HK100Mでは時間経過とともに蛍光強度の増加が認められたのに対し、3-HKl,10Mでは、その作用はほとんどみられなかった。すなわち、低濃度の3-HKが酸化ストレスを誘発するには別の因子が必要であると考えられた。そこで、どのような内在性の活性酸素産生機構が関与するかを、各種阻害剤を用いて検討した。その結果、monoamine oxidase A、B;NADPH oxidaseの各阻害剤は、いずれも3-HK毒性に影響を与ず、cyclooxygenase、lipoxygenaseの阻害剤はむしろ毒性を増強させた。一方、xanthine oxidase阻害剤であるallopurinolは3-HK(1-10M)による毒性を有意に抑制した。allopurinolは3-HKとの共添加よりも、24時間前処置を行った方がより強い抑制効果を示した。他のxanthine oxidase阻害薬であるoxypurinol、内在性xanthine dehydrogenaseからのxanthine oxidaseの生成を阻害するセリンブロテアーゼ阻害薬であるaprotininも3-HK毒性を有意に抑制した。また、allopurinolは3-HKによる細胞内過酸化水素量の増加も有意に抑制した(Fig.3B)。これらの結果より、3-HKによる神経細胞死が内在性のxanthine oxidase活性に依存していることが示唆された。

Fig.2.Catalase.But Not SOD Blocks 3-HK Toxicity.

Fig.3.Intracellular Accumulation of Peroxides Induced by 3-HK (10M)and Its Blockade by Catalase (A)and Allopurinol(B).

　3-HKは中性アミノ酸トランスポーターを介して細胞内に取り込まれることが報告されている。線条体神経細胞における[³H]-tryptophanの取り込みに対する3-HKの作用を検討した結果、3-HKはこれを濃度依存的に抑制した。また、3-HK10Mによる神経細胞毒性は過剰の中性アミノ酸によって有意に抑制された。しかし、この抑制作用は酸性及び塩基性アミノ酸では認められなかった。一方、中性アミノ酸による抑制作用が3-HK100Mに対しては認められなかったことから、3-HK毒性には2種の異なる毒性発現機構が存在することが示唆された。すなわち、(1)低濃度域(1-10M)では、3-HKは中性アミノ酸トランスポーターによって細胞内に取り込まれた後、xanthine oxidaseによる酵素的酸化反応によって、一方、(2)高濃度域では、細胞外での非酵素的自動酸化反応によって、酸化ストレスを誘導し細胞死を誘発するという仮説が考えられる。

　近年、種々の神経変性疾患で認められる細胞死がアポトーシスの形態をとることが報告されてきている。そこで、3-HKがどのタイプの細胞死を誘発するか検討した。3-HK毒性はタンパク合成阻害剤(cycloheximide)、RNA合成阻害剤(actinomycin D)によって有意に抑制された。acridine orangeを用いた形態観察では、3-HKで処置した細胞では、クロマチンの凝集が認められ、また、TUNEL法を用いてDNAの断片化を検討したところ、3-HK処置細胞でTUNEL陽性細胞の増加がみられた(Fig.4)。これらの作用はcycloheximideの共添加により顕著に抑制された。これらの結果は、3-HKがアポトーシス性神経細胞死を誘導することを示している。

　神経変性疾患の典型的な病理像の一つとして、somatostatin及びneuropeptideY含有神経細胞が変性を免れることが知られている。そこで、この細胞種に対する3-HKの作用を検討した。培養1週間後に3-HKを添加し、48時間後に固定、上記の神経細胞の指標としてNADPH diaphorase染色を施し、陽性神経細胞数を計数した。NADPH diaphorase陽性神経細胞数は3-HK1,10Mによって影響を受けなかった。しかし、3-HK 100Mでは、この選択性はみられなかった。

　神経変性疾患では、特定の部位が選択的に障害を受ける。例えば、HDでは、線条体において、他の部位と比較して顕著な変性萎縮が認められる。そこで、大脳皮質、線条体、海馬、小脳神経細胞に対する3-HKの作用を検討した。3-HK1-10Mに対して大脳皮質および線条体由来の神経細胞では顕著な毒性が認められ、海馬神経細胞にも弱い毒性が観察された。一方、小脳神経細胞では、この細胞死は認められなかった。3-HK毒性を媒介すると考えられる過酸化水素、3-HK代謝物である3-HAではこの部位選択毒性はみられなかった(Fig.5)。3-HKトランスポータは、大脳皮質、線条体に多く、小脳では少ないことが報告されている。これらの結果は、3-HK毒性がアミノ酸トランスポータに依存していることを支持するとともに、3-HKが線条体、大脳皮質に選択的に強力に作用しうる神経毒性物質である可能性を示唆している。

Fig.4.In situ Labeling of 3-HK-induced DNA Strand Brakes And Its Blockade by Cycloheximide(CHX)by The TUNEL Technique in Striatal Cultures.

Fig.5.3-HK(A),but Neither H₂O₂(B)Nor3-HA(C)Causes Region-selective Neurotoxicity.