Am580に異なる長さのスペーサーを介してダンシル基を結合させた蛍光性リガンドDAM-3・DAM-15は[³H]Am80を用いた結合競合試験からhRARに特異的に結合することが確認された。これらのリガンドの蛍光強度はhRARを共存させることにより顕著に増大し、ダンシル基が疎水的環境に取り込まれていることを示唆している(Fig.2)。そこで特異的結合に起因する蛍光強度増大を評価するため各種レチノイドを競合剤として添加したところ、特異性はDAM-3とhRARの間にのみ見られた(Fig.2斜線部)。このことからhRARに特異的に結合しながら蛍光強度の特異的な増大が見られないDAM-15は、結合した際にそのダンシル基が蛋白外部に存在していると考えられ、一方DAM-3は、hRARに特異的に結合した際にそのダンシル基が蛋白内部に存在すると判断された。フリーのリガンドを除去することなくhRARを検出できるDAM-3の蛍光性プローブとしての有用性が確認された。

Fig.2 RAR-Dependent increase of Relative Fluorescence intensity of DAM-3 and DAM-15

　DAM-3のダンシル基を5-azido naphthalene-1-sulfonyl基に変換したADAM-3は、その光反応基がダンシル基と同様に蛋白内部に存在することが期待され、DAM-15の誘導体ADAM-15と比較して光ラベル剤として適切であると考えられる。また、リガンド結合部位のより直接的な標識を目的としたAm540P、蛍光性アンタゴニストの誘導体LE622の合成も行なった(Fig.1)。

【融合蛋白MBP-RAR/Eの光親和性標識】

　光親和性標識の対象としてhRARのD/E/F領域(279アミノ酸残基)をマルトース結合蛋白のC末に融合させたMBP-RAR/Eを選んだ。結合競合試験の結果、上記の光親和性標識剤はいずれもMBP-RAR/Eに対する特異的結合能力を有していることが確認された。MBP-RAR/Eをこれらの光親和性標識剤存在下で光照射し、非可逆変性の後4種のエンドプロテアーゼ(Arg-C,Asp-N,Glu-C,Lys-C)で消化した。ADAM-3存在下で光標識した場合は、各エンドプロテアーゼ処理に対してHPLC上でそれぞれ2つの蛍光性ピークが得られた。Am80共存下でADAM-3による光親和性標識を行なった際にはこれらの蛍光ピークの強度は顕著に減少し、これらはADAM-3の特異的結合に由来していることが確認された。ADAM-15・LE622の場合は明らかに特異的と判断される蛍光性ピークは検出されなかった。Am540P存在下で光照射されたMBP-RAR/Eは[³H]Am80の結合能が著しく低下することから効率の高い標識が推測され、300nmのUV吸収の追跡により特異的にAm540Pを結合したと考えられるフラグメントが検出された。

　光親和性標識剤の結合において、特異性と効率に優れていたADAM-3とAm540Pの場合について結合部位の解析を行なった。

　ADAM-3の結合した蛍光性ペプチドフラグメントを分取し、1回目に用いたものとは異なるエンドプロテアーゼで2回目の消化を行い、HPLC上の保持時間の変化の有無を調べることにより、ラベル部位周辺のエンドプロテアーゼ認識部位の前後関係を求めた(Fig.3)。1回目と2回目の消化で用いるエンドプロテアーゼの順番を入れ替えた2段階消化の対において、消化の結果同一の保持時間を与える蛍光性ピークを組合せることにより1回目の各消化でそれぞれ2つ得られた蛍光性ピークを2つの特異的な標識部位に帰属して対応関係を同定した。

Fig3.Concept of Endoproteinase Combination Method

　2段階消化実験により各標識部位周辺のエンドプロテアーゼ認識部位の前後関係に対して12の条件が得られ(Table 1)、これらを満たす配列をMBP-RAR/Eの中から探した結果、一方の標識部位に対してアミノ酸番号492-510(hRARで288-306)の配列のみが全ての条件を満たした。もう一方の標識部位に対する12の条件をすべてみたす配列は、MBP-RAR/Eの中に存在せず、エンドプロテアーゼに認識されていない部位が存在していることが推測された。そこで1つの認識部位がADAM-3の結合により認識不可能になっていると考え、1つのエンドプロテアーゼを除外した3つのエンドプロテアーゼの組合せを作り、それぞれの条件を満たし、かつ除外されたエンドプロテアーゼの認識部位を含む配列を探したところ、4つの配列が条件を満たした。さらに認識されなかった部位を特定し、これらの配列に再び12の条件を適用すると、Arg-Cに認識されないArgを含むと仮定した585-594の配列のみが全ての条件を満たした。よってもう1つの標識部位はArg589あるいはその近傍であると推定された。

Table1.Results of the Successive Endoproteinase Digestions for the Two Labeled Sites

　同様にAm540Pを結合したと考えられるフラグメントに対しても2段階エンドプロテアーゼ処理を行ない、得られた12の条件を用いた検索を行なった結果、これらの条件を全て満たす595-597の配列が標識部位として決定された。この配列を直接的な方法で確認するため、Lys-C処理で得られた特異的フラグメントをエレクトロスプレーイオン化法による質量分析で検出することを試みた。エンドプロテアーゼコンビネーション法により決定した標識ペプチド(595-603)の分子量1306に対して、プロトンが2つ付加した2価イオンの測定値として654のシグナルが検出された。

　本研究中にhRARリガンド結合領域とall-trans-レチノイン酸との複合体のX線結晶構造解析が行なわれ、核内レセプター間で共通すると考えられるホロフォームの基本構造が示されたが、hRARとhRARのリガンド結合領域における一次構造の相同性はかなり高く、今回用いたMBP-RAR/Eも含めてその3次元構造は類似していることが予想される。この仮定の上に立つと、今回ADAM-3による光親和性標識部位として決定したMBP-RAR/Eの492-510の残基は、レチノイン酸のカルボキシル基の外側に位置するストランド2・ヘリックス6を形成すると推測され、妥当な標識部位であると考えられる。もう1つのADAM-3による標識部位であるArg589近辺も結合ポケットの内部に接する配列とみなすことができる。Am540Pによる標識部位である595-597の配列は、all-trans-レチノイン酸のシクロヘキセン環部分と直接相互作用するヘリックス11の1部に相当し、リガンド結合部位のより直接的な標識と標識された配列の決定に成功したと考えられる。

Fig.4 Mapping of the Photoaffinity Labeled Sites

　ADAM-3及びAm540Pにより光親和性標識された配列を決定するために用いられたエンドプロテアーゼコンビネーション法は、エドマン分解を用いずに限られた配列を特定できる点や標識の効率の高さを問題にしない点・操作の簡便さなどの点で優れている。しかし1つの残基を特定することができないこと、エンドプロテアーゼの認識部位が修飾された場合に解析が複雑になること、などの限界もみられる。近年技術的進展が著しい質量分析によるペプチドの解析法などと組合せた場合、この手法はより有用となると考えられる。