非相同的組換えによる欠失変異を特異的に検出する実験系を出芽酵母を用いて作製した。この系では二つのネガティブ選択が可能な遺伝子、CAN1,CYH2を用いてYCpプラスミド(YCpL2)上のCAN1-CYH2領域で起こる欠失変異を定量的に検出することができる(Fig.1)。この実験系では欠失変異が8.5×10^-8/cell/division cycleの割合で検出され、またその欠失変異はCAN1-CYH2領域の様々な部位で起きており、組換え部位の塩基配列の解析から1-5塩基対の短い相同性しか認められない非相同的組換えによって起こっていることを確認した。

Fig.1非相同的組換えによる欠失変異を検出する実験系

　欠失変異を引き起こす非相同的組換えに関与する因子を明らかにするため、DNA二本鎖切断修復や相同的組換えに必須なRAD52遺伝子群における非相同的組換え頻度を調べた。その結果rad52,rad50,mre11,xrs2変異株では頻度が野生株に比べ1/10-1/30に低下していることが明らかになった(Fig.2)。この結果はこの系で検出される非相同的組換えの大部分がRad52,Rad50,Mre11,Xrs2の機能に依存していることを示しており、相同的組換えに働く因子の中に非相同的組換えにも働く因子が存在することが分かった。

　この実験系を用いてさらにrad変異株以外の種々の変異株を用いて調べた。その結果出芽酵母のKu抗原ホモログをコードするHDF1遺伝子の変異株で欠失変異の形成頻度が下がることが分かった(Fig.2)。哺乳動物ではDNA二本鎖切断修復や免疫抗体産生の際のV(D)J組換えにXRCC6遺伝子産物であるKu抗原が関与することが知られているが、そのKu抗原のホモログであるHdf1が出芽酵母では非相同的組換えに働いていることが明らかになった。

Fig.2rad,hdf1変異の非相同的組換えによる欠失変異への影響

　Rad52,Rad50,Mre11,Xrs2,Hdf1が非相同的組換えへに関与することが明らかになったが、これらの因子が働く過程、つまりこれらの因子が欠失変異形成の際DNA二本鎖切断を導入する過程に働くのか、あるいは切断後に働くのかという点を明らかにするため、この実験系ではYdCp2プラスミド、DNA二本鎖切断が高頻度で生じると考えられている動原体を二つ持つプラスミドを用いる(Fig.3)。動原体を二つ持つプラスミドを細胞内に導入すると細胞分裂期に二つの動原体が娘、母細胞に互いに引っ張られるため、高頻度でDNA二本鎖切断が二つの動原体の間に引き起こされると考えられている。YCpL2プラスミドに動原体をもう一コピー挿入し、動原体を二つ持つプラスミド(YdCp2)を作製し、高頻度で二本鎖切断が起こる条件で非相同的組換えを調べられるように工夫した。

Fig.3動原体を二つ持つプラスミドを用いたEnd-joiningによるDNA二本鎖切断修復を検出する実験系

　動原体を二つ持つYdCp2プラスミドを用いて調べたところ、野生株においては動原体を一つしか持たないプラスミドYCpL2を導入したときと比べ非相同的組換えが約16倍高い頻度で検出されることが分かった。またrad52,rad50,mre11,xrs2,hdf1変異の影響について調べたところrad50,mre11,xrs2,hdf1変異株ではこの組換え頻度が野生株の約1/50に低下したが、YCpL2プラスミドを用いた系での結果とは異なり、rad52変異株では野生株と組換え頻度について有意な違いは認められなかった(Table1)。これらの結果からRad52についてはDNAに二本鎖切断を導入する過程に働いている可能性と、YCpL2プラスミドの二量体形成の際の相同的組換えの過程に働いている可能性が考えられるが、今のところどちらかは分からない。またRad50,Mre11,Xrs2,Hdf1はDNA二本鎖切断が起きた後の修復過程つまりEnd-joiningの過程に関与していることを示唆している。Rad50,Mre11,Xrs2は複合体を形成し、また大腸菌のDNA exonucleaseと部分的な相同性を有するので、DNA末端をプロセスして再結合を促進している可能性が考えられる。またHdf1はDNA末端に結合する活性があることが知られているので、DNA末端に結合することでDNAの消化を防ぎ再結合を促進している可能性が考えられる。

Table1動原体を二つ持つYdCp2プラスミドにおける欠失変異の頻度

　End-joiningにおけるHdf1の役割についてさらに解析を進めるため、Hdf1と相互作用する因子をTwo-hybrid systemを用いて探索した。スクリーニングの結果、Hdf1と相互作用することが予想される四種類の因子が単離され、これら四つの遺伝子について遺伝子破壊を行ない、上記の二つの実験系を用いてEnd-joiningへの関与について調べた。この四つの因子の中で、Sir4ついてEnd-joiningに関与することを示唆する結果が得られた。

　Sir4はテロメア周辺や接合型変換の際のHM遺伝子座での遺伝子発現のsilencingの制御に関与しており、細胞の老化やテロメア形成にも関与することが知られている因子である。同じくsilencingの制御に関与している因子の中からSir1、Sir2、Sir3についてEnd-joiningへの関与を調べた。遺伝子破壊株を作製し、上記の二つの実験系を用いて解析したところ、Sir2、Sir3がSir4と同様にEnd-joiningに関与していることが示唆された。別の実験系を用いて、SIR遺伝子産物のEnd-joiningへの関与について調べた。この実験系は、制限酵素を用いて二本鎖切断したプラスミドDNA断片を細胞に導入して、DNA末端のEnd-joiningによる再環状化を検出する系である。sir変異株での、導入した線状DNAのEnd-joiningによる再環状化の効率は、プラスミドYCpL2やYdCp2を用いて得られた結果と同様に、sir2、sir3、sir4変異株では野生株の1/10以下にが下がったが、sir1変異によっては影響を受けなかった(Figure4)。またsir4 hdf1二重変異株でのEnd-joiningの効率が、sir4変異株とhdf1変異株と同程度しか下がらなかったことから、Sir4はHdf1と同じ経路で働いていると考えられた。

Efficiency of End-joining