m-カルパインの活性化機構として、近年、サブユニットの解離という現象をもとにしたモデルが議論されている。しかし、このサブユニットの解離を起こすにはm-カルパインがin vitro活性化に必要とするよりも非常に高いカルシウム濃度(2mM程度)を要求するため、サブユニットの解離を直接の活性化機構として考えることは困難であった。しかし、本研究ではゲル濾過クロマトグラフィーを用いた解析により、カルパインが活性化に必要とするカルシウム濃度以下の低カルシウムの条件(500M)においてもm-大サブユニットと小サブユニットが解離している可能性を示唆した。このような低いカルシウム濃度での大サブユニットの解離は、系に存在するm-カルパイン分子のうち約20%以下の分子に起こっていたと考えられた。また、従来通りに高いカルシウム濃度で処理することで得た単独のm-カルパイン大サブユニットの活性についての解析の結果、高濃度のカルシウムを含む溶液とカルパインが接触すると、カルパインの触媒活性を担う大サブユニットに非可逆的な変性を起こさせ、その結果、何も処理していないダイマーのm-カルパインと比較して失活がはやい、自己消化後の残存活性が低い等、酵素的な性質の変化をもたらすことを明らかにした。

　カルパインの自己消化とサブユニットの解離について、自己消化しているカルパインではサブユニットの解離が非可逆的に起こってたという報告がなされている。そこで、カルパインの活性化機構について、活性化に先立って自己消化が先ず起こり、それによってサブユニットの解離が非可逆的に起こるのではないかと考えられるようになった。本項では自己消化を起こしたm-カルパインサブユニットの非可逆的な解離はどのような原因で起こるのかについて考察した。様々なカルシウム濃度で自己消化処理をしたm-カルパインのゲル濾過クロマトグラフィーでの解析の結果、サブユニット解離の非可逆性が現れるのは、m-カルパインを1mM以上の高濃度のカルシウム濃度において自己消化させた場合に限られることが明らかとなった。高濃度のカルシウムイオンの添加によって単離したカルパイン大サブユニットの性質変化を考慮すると、サブユニット解離の非可逆性は、高いカルシウム濃度でのm-カルパインの変性が原因であったとも解釈できる。前項の結果と併せて、ミリモルオーダーのカルシウムイオンとm-カルパインとを接触させるとカルパイン分子に修復不可能な変性が起こり、カルパインの酵素的な性質を変化させることを明らかにした。

　カルパインの活性化機構の解明にはカルシウム感受性などの障害がある。これらの障害を、カルパイン分子のみに起こる変化によって説明しようとする他に、カルパインに結合して,何らかの影響を与える因子の存在を想定することで障害の克服を試みる研究がこれまでに幾つかなされてきた。実際にカルパインの活性を変化させることのできる物質を含む画分は生体材料から分離されたが、その原因物質は何であるのかが特定された例はない。しかし、本研究では、タンパク質の架橋剤を用いた解析法により、m-カルパイン小サブユニットと結合するタンパク質を検出することに成功し、アミノ酸分析により、そのタンパク質が14-3-3蛋白質ファミリーの一員の14-3-3蛋白質""であることをつきとめた。m-カルパインと結合するタンパク質が特定されたのは初めてで、m-カルパインと14-3-3蛋白質との結合により情報伝達をになう蛋白質を協調的に制御する、生命現象に必須な分子としてのカルパインの生体内での機能が強く示唆された。また、m-カルパインの結合タンパク質が存在することはカルパインの活性化機構を考える上でも大きなヒントとなり、今後の研究への新たな方向性を示したと言える。

　m-カルパイン結合タンパク質である14-3-3蛋白質がカルパインに及ぼす影響は何であるのかという点について、本項においては、m-カルパインが14-3-3蛋白質を結合しているときとしていないときに、その活性に変化があるのかという点について検討した。その結果、14-3-3蛋白質は、カルパインのカルシウム感受性や活性強度をを劇的に変化させる因子ではないことが明らかとなった。また、これまでの解析では用いられていなかった基質であるスペクトリンを用いた解析により、14-3-3蛋白質と結合していると考えられるカルパイン分子では、スペクトリンに対する基質特異性が変化することも明らかにした。これらの結果から、結合タンパク質である14-3-3蛋白質によって、m-カルパインは、生体内での基質に対して正しい切断部位を認識できるようになるのではないかと考えられた。