動物半球と小割球からなる再構成胚は原腸、色素細胞、胞胚腔細胞、筋肉細胞の予定領域を含まない。小割球からの誘導で、動物半球細胞がこれらの全ての種類の細胞に分化するかどうかを調べるため、再構成胚作成実験を行なった。

　再構成胚でも正常胚同様にPMCの胞胚腔への移入に続いて原腸陥入が始まり、原腸先端からSMC様細胞(以下induced SMC)が出現した。この原腸とinduced SMCは蛍光色素を用いた細胞系譜追跡実験の結果、共に動物半球由来である事が確かめられた。さらに再構成胚由来のプルテウス幼生において、色素細胞、胞胚腔細胞、筋肉細胞、体腔嚢細胞の4種全てのSMC由来中胚葉細胞の分化が確認された。細胞系譜追跡実験から、少なくとも色素、胞胚腔、筋肉細胞の3種は動物半球由来であることが明らかになった。さらに再構成胚から、胞胚期以降に小割球子孫細胞を完全に除去する実験を行なった結果、小割球からの誘導を受けた動物半球由来細胞のみからなる実験胚にも体腔嚢が分化することが確認された。

　以上から、小割球は、再構成胚において、原腸と全てのSMC由来中胚葉細胞の分化を誘導する能力を持つことが明らかになった。

　正常胚から実験的にPMCを除去した場合、正常発生過程では骨片形成能を発現しないSMCが骨片形成細胞に分化することが知られている。これはSMCの機能的特徴である。この潜在的骨片形成能が、予定外胚葉由来である再構成胚のinduced SMCにも備わっているかどうかを確かめるため、再構成胚のPMCを全て除去した。

　PMCを除去された再構成胚のinduced SMCのうち、一部の細胞は本来PMCが骨片を形成する領域である胞胚腔の植物極側に移動して、そこで正常胚の骨片と同様の形態的特徴を持つ骨片を形成した。そして、実験胚はプルテウス幼生に発生した。この時、induced SMCはPMCに特異的に発現する細胞表面糖蛋白質のひとつであるmsp130を発現している事が蛍光抗体法で示された。

　以上の実験から、予定外胚葉細胞に由来するinduced SMCも、正常胚のSMCと同様に、PMCの非存在下で発現される潜在的な骨片形成能を持っていることが明らかになった。この結果は、再構成胚のinduced SMCが、第一章で示したように正常胚のSMCと形態の点のみならず、潜在的な機能の点からも同等であることを示している。

　第一章、第二章の研究から、小割球からの誘導によって、動物半球細胞の一部は発生運命を変更し、原腸とinduced SMCに分化する事が明らかになった。つぎに、小割球からの誘導の起きている時期を明らかにするために、以下の実験を行なった。

　まず最初に、原腸誘導に十分な動物半球と小割球との接触期間を明らかにするため、再構成胚から様々な時期に小割球子孫細胞を除去する実験を行なった。その結果、媒精後8時間までに小割球子孫細胞を除去した場合、実験胚はほとんど原腸を形成しないが、それ以降での除去では原腸分化が起こった(図1)。この実験から、原腸誘導には小割球と動物半球が媒精後8時間(胞胚期)まで接触していればほぼ十分であることがわかった。

図1:媒精後の様々な時間に再構成胚から小割球子孫細胞を除去した場合の原腸形成率(nは実験個体数)

　次に、媒精後8時間まで単離培養条件下においた小割球を32細胞期の動物半球と組み合わせる実験を行なった。その結果、発生段階の異なる細胞を組み合わせた再構成胚でも原腸誘導の起こることが明らかになった(図2)。この結果は、小割球子孫細胞が単離培養条件下でも原腸誘導活性を発現する能力を失わない事を示している。

図2:発生段階の異なる動物半球と小割球からなる再構成胚から小割球子孫細胞を除去した場合の原腸形成率(nは実験個体数)。A+8hM:32細胞期の動物半球と媒精後8時間まで単離条件下においた小割球子孫細胞を組み合わせた再構成胚。A+XhM・M(2h):32細胞期の動物半球と媒精後X時間まで単離条件下においた小割球子孫細胞を組み合わせた再構成胚から小割球子孫細胞だけを再構成後2時間目に除去したもの。

　また、媒精後8時間まで単離培養条件下においた小割球子孫細胞と32細胞期動物半球を組み合わせ、再構成後2時間目に小割球子孫細胞を完全に除去した場合、実験胚は原腸を形成した。しかし、媒精後6時間まで単離条件下においた小割球を32細胞期動物半球と2時間接触させる実験を行なった場合には、ほとんど原腸が形成されなかった(図2)。この実験から、(1)単離培養条件下の小割球子孫細胞の、動物半球細胞に対する原腸誘導活性は媒精後8時間以降に顕著になること、(2)32細胞期から2時間後までの動物半球も、小割球子孫細胞が誘導能を発現していれば、それに反応する能力を持つことと、(3)原腸誘導に重要な細胞間相互作用には、誘導能を発揮している小割球子孫細胞と動物半球の2時間の接触で十分であることが明らかになった。上記の一連の実験結果から、小割球子孫細胞は胞胚期になって原腸誘導活性の発現を開始していると考えられる。

　上記の各実験で得られた実験胚を飼育した結果、正常胚と形態的に区別できない後期幼生をへて変態し、稚ウニにまで発生した。この稚ウニを構成する細胞は、その全てが予定外胚葉領域由来だが、個体発生初期に小割球からの誘導を受けている。この結果は、個体発生初期(胞胚期)の、小割球子孫細胞からの短い期間(数時間)の誘導が後期発生過程における正常な細胞分化を方向づけるのに十分であることを示唆している。

　今回の一連の研究から、小割球子孫細胞は、予定外胚葉領域である動物半球にたいして、形態的にも、細胞の潜在的な機能の面からも正常胚のものと変わらない原腸と全ての種類のSMC由来中胚葉細胞の分化を誘導する能力を持つことが明らかになった(第一章、第二章)。さらに小割球子孫細胞が予定外胚葉細胞にたいして原腸を誘導する活性を発現しているのは胞胚期であることが示された(第三章)。Ransick & Davidson(1995)は、卵割期(16-32細胞期)における小割球および小割球子孫細胞からの誘導シグナルが、正常胚の大割球による原腸形成に重要であることを示していた。またDavidson(1989)が提唱しているウニ胚発生運命決定機構に関する仮説は、再構成胚においても卵割期に小割球が誘導シグナルを発現することを必要としている。しかし、今回の再構成胚を用いた実験において、小割球子孫細胞は卵割期には動物半球細胞に原腸を誘導することはできないが、胞胚期には原腸誘導活性を発現した。したがって、小割球および小割球子孫細胞の発現する誘導活性には、Ransick & Davidson(1995)によって示された卵割期初期に現われる初期誘導シグナルと、本研究によって初めて明らかにされた胞胚期に発現する後期誘導活性の少なくとも2種類が存在する可能性が示唆される。この2種類の誘導活性のそれぞれ、特に後期誘導活性が、正常胚の発生運命決定機構においてどのような役割をはたしているかについては今後の研究課題として残されている。