栄養条件下において自食作用を誘導する変異株を単離するために、アルカリ性ホスファターゼ(ALP、Pho8p)活性に基づいた自食作用の生化学的な検出法を用いた。液胞膜タンパク質であるALPは、前駆体として合成され、分泌経路を通って液胞に輸送されると液胞内プロテアーゼによる成熟化を受け活性を獲得する。ALPの膜貫通領域を欠失させたPho860pは細胞質中に存在し、栄養源飢餓条件下に自食作用の進行に伴って液胞へ輸送されると初めて成熟化を受け、ALP活性を提示する。Pho860pを発現する野生型酵母細胞を変異原処理し、富栄養培地プレート上でALP活性を示すコロニーを選択した。それらの中から、光学顕微鏡観察により、液胞内にオートファジックボディを蓄積する変異株を4株単離した。遺伝学的解析の結果、これらはいずれも核性の単一劣性変異であり、2つの相補群(csc1,csc2:Constitutive Sequestration of Cytosol by autophagy)に分けられた。

　csc1-1、csc2-1変異株のPRB1遺伝子を破壊した結果、csc1-1/prb1、csc2-1/prb1二重変異株細胞のいずれにおいても、栄養培地中で液胞内にオートファジックボディの蓄積が観察された。さらに、csc1-1、csc2-1変異株細胞で見られるALP活性が、これらの二重変異株では検出されないことから、csc変異株におけるALPの活性化は、Pho860pが液胞内に輸送されたことをを示す。

　Apg1タンパク質は、その活性が、自食作用の誘導に必須なセリン/スレオニン型プロテインキナーゼである。csc1-1、csc2-1変異株のAPG1遺伝子を破壊したところ、これらの二重変異株のALP活性は、いずれにおいても野生型株の示すレベルに低下した。以上の結果より、csc変異株では、栄養条件下においても自食作用が誘導されていることが示された。

　csc1-1変異株の窒素源飢餓条件下での生存率の低下、並びに富栄養培地中での自食作用の誘導という変異形質の抑圧を指標に、CSC1遺伝子を酵母のゲノムライブラリーより単離した。CSC1遺伝子は437アミノ酸残基からなるAAA(ATPase Associated to a variety of cellular Activity)ファミリーに属する親水性のATPaseをコードする。AAAファミリーに属するタンパク質は、膜融合過程(NSF/Sec18p)やオルガネラの形成過程(Pas1p、Pas8p)等、細胞内の様々な現象に関わっているが、それらに共通する機能は明らかではない。csc1-1、csc1-2変異株における変異部位を決定した結果、いずれも291番目のグルタミン酸がリジンに置換した同一の変異を持つことが明らかになった。この変異は、SRH領域と呼ばれるATP水解活性領域の他にAAAファミリーで高度に保存された領域に起こったものである。SRH領域の機能は未だ解明されていないが、AAAファミリーに共通する機能を知る上で重要であると考えられている。

　CSC1遺伝子産物(Csc1p)の機能を解析するために、csc1遺伝子破壊株(csc1)を作製した。csc1株は生育可能であり、栄養培地中での増殖遅延も見られなかった。Csc1pに対して作製した特異抗体を用いたイムノブロッティングの結果、Csc1p及びCsc1p^E291Kはいずれも安定な約50kDaのタンパク質であった。細胞分画法により、細胞内での局在様式を検討した結果、いずれのタンパク質も主に細胞質中に遊離の状態で存在し、一部が沈殿画分に検出され、その局在様式に大きな変化は見られなかった。これより、csc1-1変異株で見られる栄養条件下での自食作用の誘導は、Csc1pとCsc1p^E291Kの間の量的安定性並びに局在性の違いによるためではないと考えられる。

　栄養条件下での自食作用の誘導を検討した結果、csc1株では自食作用を反映するALP活性が検出されなかった。csc1株中で、csc1-1(csc1^E291K)を多コピーベクター上で発現させるとALP活性の上昇が見られた。さらに、野生型細胞中で、Csc1p^E291Kを過剰発現させることで、栄養条件下での自食作用が観察された。これより、csc1^E291Kは、過剰発現させることで優勢に働く、gain-of-function変異であることが示された。ATP水解活性領域内の179番目のリジンをアラニンに置換したcsc1^K179AE291Kをcsc1株に導入することにより、ATP水解活性が栄養条件下での自食作用の誘導に関わるか検討した。csc1^K179AE291Kを導入したcsc1株は、自食作用を反映するALP活性がATP水解活性領域内にのみ変異を持たせたものと同様に低い値を示した。これらの結果は、Csc1p^E291Kが、ATPaseとしての機能を有しており、その活性が栄養条件下での自食作用の誘導に関わっていることを示唆する。

　CSC1遺伝子は液胞タンパク質やエンドサイトーシスによって取り込まれた物質の液胞への輸送に必要なVPS4/END13/GRD13と同一であった。vps4の属するクラスE vps(vacuolar protein sorting)変異株群では、クラスEコンパートメントと呼ばれる蛍光色素FM4-64によって染色される構造体が蓄積する。この構造体は、後期エンドソームが肥大化したものと考えられている。csc1-1変異株をFM4-64で処理すると、クラスEコンパートメントが観察された。この蛍光像は、csc1株においても見られるが、野生型株では観察できない。このことは、Csc1pが後期エンドソームの機能に重要な役割を担っており、csc1-1変異によってその機能が果たせなくなることを示している。さらに、液胞タンパク質カルボキシペプチダーゼYの輸送に対するcsc1-1変異の影響を検討した結果、csc1株同様に、ゴルジ体型前駆体が細胞外に分泌されていた。以上の結果は、Csc1p/Vps4pが後期エンドソーム機能に関与することを表している。