カイコ4齢4日目幼虫から採取した血液を一定時間室温に放置した後、4齢1日目幼虫に注射すると、全身の筋肉の収縮・麻痺が観察され、注射量の増加とともに麻痺継続時間は長くなった。また、麻痺活性は採血1分後の血液でも検出され、20分後に最大になり、30分後にやや低下した。しかしながら、空気に触れないように採血した血液では麻痺活性は検出されなかった。また、この麻痺活性はトリプシン処理により消失することからペプチド性の物質によるものであると考えられた。

　次に、カイコ4齢4日目および5齢1日目の幼虫(180匹)から採集した19mlの血液から、50%アセトン沈澱(活性区は上清)、Vydac C₄カートリッヂおよび4段階の逆相HPLCを用いた精製法により、活性物質(麻痺ペプチド)を単離した。単離した麻痺ペプチドは3.7ngでカイコ4齢幼虫を1分間以上麻痺させる活性を示した。活性の回収率は35%であった。

　単離した麻痺ペプチドの構造解析を行うため、まず、TOF-MSによる質量分析を行った。その結果、m/z2456.5の単一なイオンピークが得られたことから精製した麻痺ペプチドは構造解析に充分な純度であり、20〜30残基のペプチドであることが予想された。次に、精製したペプチドおよび還元アルキル化したペプチドの配列分析により、N-末端のグルタミン酸から23残基目のフェニルアラニンまでのアミノ酸配列および分子内に2残基のシステインが存在することを明らかにした。また、この配列から予想される分子量は2,460(システインは分子内でジスルフィド結合を有し、ペプチドのC-末端は遊離型として計算)であることおよびTOF-MSで得られた分子量が2,456.5であることから、麻痺ペプチドは23残基のペプチドであり、C-末端はフェニルアラニンであると推定された。さらにFAB-MSによる質量分析から単離したペプチドが23残基のペプチドであることを決定するとともに、2残基のシステインは分子内でジスルフィド結合形成し、C-末端のフェニルアラニンは遊離型であることが示された(図-1)。

図-1 カイコ麻痺ペプチドの化学構造

　続いて推定した構造を確認するためにFmoc法によりペプチドを合成し、逆相HPLCを用いて天然物との比較を行った。その結果、推定どおりカイコ麻痺ペプチドはC-末端遊離型で、ペプチド鎖内にジスルフィド結合を持つ合成ペプチドと同じ保持時間で溶出されることが確認された。また、合成品も天然物と全く同じ濃度で活性を持つことを確認した。さらに、類縁体を合成し、その活性を調べたところ、C-末端アミド型ペプチドは天然型と同等の活性を、また、N-末端にチロシンを付加したペプチドは約半分の活性を示したが、N-末端やC-末端のアミノ酸を一残基以上欠失したものでは天然型の千倍量を注射しても活性を示さなかった。これらの結果から麻痺活性を示すには23残基の全ての配列が必要であるが、C-末端がアミド型であったり、N-末端が伸長していても活性を示すことが明らかとなった。特に、N-末端にチロシンを付加したペプチドが活性を維持していたことから、¹²⁵Iでラベルしたペプチドを用いた受容体の検索などが可能であることが示された。また、分子内のジスルフィド結合を還元アルキル化することで麻痺活性が無くなることからジスルフィド結合が活性発現に重要であることが示された。

　カイコ麻痺ペプチドの産生器官や産生組織を明らかにし、さらに、生体内での不活性化機構解明の手がかりとして前駆体構造を明らかにするために、cDNAのクローニングを試みた。まず、消化管を除いたカイコ4齢幼虫全体から調製したmRNAを鋳型とし、麻痺ペプチドのアミノ酸配列をもとに合成したプライマーを用いてRT-PCRを行った。次に、RT-PCRによって得られた部分配列をプローブとして、同じmRNAを用いて構築したcDNAライブラリー、約1.5x10⁵クローンについてスクリーニングを行った。得られた7個の陽性クローンの解析の結果、カイコ麻痺ペプチドcDNAは131残基のペプチドをコードしており、N-末端にシグナルペプチドと予想される疎水性ペプチドを、C-末端に23残基の麻痺ペプチドをコードしていた(図-2)。麻痺ペプチドのC-末端である23残基目のフェニルアラニンの後ろは終止コドンであり、ペプチド側から得られたC-末端は遊離型であるという結論を支持していた。また、麻痺ペプチドのN-末端側にアルギニンが存在することから前駆体タンパク質からトリプシン様のプロテアーゼにより麻痺ペプチドが切り出されると思われる。

図-2 麻痺ペプチド前駆体タンパク質の構造

　また、麻痺ペプチドの産生組織、産生時期を明らかにするために、各組織および発育時期の異なるmRNAを用いたノーザンブロット解析を行ったところ、麻痺ペプチドの主要な産生組織は脂肪体であり、3齢期には発現量が低く、4齢初期や5齢初期および吐糸期、蛹期に発現量が高いことが明らかとなった。また、mRNAのサイズは0.6kbであると考えられるが、吐糸期や蛹期には1.6kbのバンドも観察された。このバンドが麻痺ペプチドのmRNAであるかどうかについては現時点では判断できず、さらに解析が必要であると思われる。

　cDNAの構造から、麻痺ペプチドは前駆体タンパク質として合成され、血液中に分泌されているものと考えられる。また、血液が空気と触れることで血液中のプロテアーゼにより麻痺ペプチドが切り出され麻痺活性を示すようになるのではないかと考えられる。そこで、大腸菌による麻痺ペプチド前駆体の発現系を構築し、さらに発現させた前駆体タンパク質を用いて血液中のプロテアーゼによるプロセシング過程を解析した。

　シグナルペプチド部分を含む麻痺ペプチド前駆体(rBMPP-1)およびシグナルペプチド部分を含まない前駆体(rBMPP-2)を発現するようpRSET-Bを用いて発現ベクターを構築し、T7RNAポリメラーゼ遺伝子を有する大腸菌BL21株に導入した。N-末端にHisタグが付加していることを利用し、Ni-NTA樹脂を用いたアフィニティーカラムにより目的タンパク質の精製を行った。さらに尿素を除いた後、麻痺活性を測定した。その結果、ともに5gでも麻痺活性は認められなかった。

　次に、rBMPP-1にカイコ4齢の血液を加え、室温で一定時間放置した後、SDS-PAGEを行い、前駆体タンパク質のプロセシングの有無を解析した。前駆体タンパク質(約20kD)は、血液と混合10分後には多少減少し、30分後には半分以下になり、2時間後には完全に消失していた。また、30分から2時間までのレーンでは約17kDのバンドが観察された。次に、麻痺ペプチドが実際に前駆体ペプチドから切り出されているかどうかを明らかにするため、グラジエントゲルを用いて同様の解析を行った(図4-5(B))。その結果、30分後には相当する分子量の位置にバンドが観察され、120分、240分後ではさらに濃いバンドが認められた。さらに、試料中に存在する麻痺活性を測定したところ、血液と混合10分後には麻痺活性が認められ、その後60分まではその活性(麻痺継続時間)が上昇し、120分後でも60分後とほぼ同じ活性をもっていた。以上の結果から麻痺ペプチドは血液中に存在するプロテアーゼによって前駆体タンパク質がプロセシングを受けて生成するものと考えられた。今後は麻痺ペプチドおよび前駆体タンパク質に対する抗体を作製し、ウェスタンブロットなどを用いて血液中に実在する前駆体タンパク質の確認やプロセシングの過程の解析を行う必要があると思われる。

　以上、本研究は、カイコ幼虫に対して麻痺活性を示すペプチドをカイコ血液から単離し、そのペプチドの化学構造の解析、遺伝子構造の解析およびプロセシング機構の解析を行ったものである。今後、本研究の成果をもとにプロセシングに関わる分子の同定やその分子機構の解析を行うことで、麻痺ペプチドの生理学的な意義を明らかにすることができると思われる。さらに麻痺ペプチドに対する受容体を同定し、その受容体分子の組織や発育時期特異的な発現を解析することにより、麻痺活性以外の未知の機能を探ることもできると思われる。