A431細胞をストレス誘導化合物である10mM2-deoxyglucose(2DG)あるいは10mM glucosamine(GlcN)で24時間処理すると、GRP78および94の発現量が増大しストレス応答が確認された(図1)。フローサイトメトリーによる細胞周期解析の結果、2DGあるいはGlcNの処理時間依存的にG1期細胞の増加と共にS期細胞の減少(G1/S ratioの増大)が認められ、ストレスによるA431細胞のG1期停止が明らかになった(図1)。

　上記のストレス環境下では、細胞増殖に十分な増殖因子(血清)が培地中に含まれているにもかかわらず増殖が抑制されることから、ストレスの増殖因子レセプターへの影響を検討することにした。A431細胞の増殖にはEGFレセプターが重要な役割を果たしていることから、ストレス環境下でのEGFレセプターの発現を調べた。EGFレセプターは、130kDdのペプチド部分の翻訳に共役して糖鎖付加され、170kDdの成熟レセプターとして細胞膜表面に発現される。2DGのストレス条件下にA431細胞を曝すと、2DGの処理時間に依存して、170kDaの成熟型EGFレセプターが減少し、その代わりに150kDaのEGFレセプターが増加した(図2A)。2DGなどのストレス誘導化合物が糖鎖合成を阻害すること、EGFレセプターの糖鎖に対する抗体の反応性が低下すること、糖鎖付加を阻害するツニカマイシン処理によって合成される130kDaのレセプターと明確に区別できることから、この150kDaのEGFレセプターは低糖鎖型(underglycosylated)のEGFレセプターであると結論された。

　EGFレセプターは、リガンドEGFの結合により活性化されレセプター自身及び特定の細胞内タンパク質のチロシンをリン酸化しシグナル伝達する。そこで、EGFレセプターのチロシンリン酸化について検討した(図2B)。A431細胞をEGF処理すると、170kDaの成熟EGFレセプターの顕著なチロシンリン酸化が認められた。一方、2DG処理によりストレス応答した細胞をEGF処理した場合には、低糖鎖型150kDaレセプターのチロシンリン酸化は検出されなかった。しかしながら、細胞を破砕後そのlysateにEGFを添加すると、低糖鎖型150kDaレセプターのチロシンリン酸化が顕著に誘導された。したがって、この低糖鎖型レセプターはEGFに対する反応性を有していることが明らかになった。EGFは細胞膜を透過できないことから、低糖鎖型150kDa EGFレセプターは細胞内に存在し、細胞外のEGFと結合できないためにEGFによる活性化(チロシンリン酸化)が起こらないものと考えられた。

　ストレスにより誘導されるGRP78は、小胞体(ER)の内腔に局在し、合成途中のタンパク質に結合し正常なフォールディングを補助したり、異常な構造を持つタンパク質や未成熟なタンパク質に結合し小胞体外への分泌を防ぐなど分子シャペロンとして機能する。ストレス条件下で合成される低糖鎖型の150kDa EGFレセプターとこのGRP78の複合体形成について免疫沈降法により検討した。2DG処理によりストレス応答したA431細胞のlysateを用い、抗GRP78抗体によって免疫沈降すると、GRP78とともに150kDa EGFレセプターが共沈した(図3A)。抗EGFレセプター抗体で免疫沈降した場合にもEGFレセプターとともにGRP78が共沈した(図3B)。したがって、GRP78と150kDa EGFレセプターは複合体を形成していることが明らかになった。このGRP78と150kDa EGFレセプターの複合体は、ATPの添加により解離されたことから(図3B)、複合体の形成にはGRP78の分子シャペロンとしての機能が関与していることが示唆された。GRP78は、ストレス条件下で合成される低糖鎖型150kDa EGFレセプターと結合することにより、レセプターを小胞体内にとどめていると考えられた。

　上記の結果より、ストレス応答したA431細ではEGFレセプターがGRP78と細胞内で複合体を形成し、細胞膜上に発現しないためにEGFからの増殖シグナルが遮断されていることが示された。このEGFシグナルの遮断が、細胞周期のG1期停止に関与するかを検証するため,G1期からS期の進行に必要なG1サイクリンのサイクリンD3の発現を調べた。Dタイプサイクリンの発現は一般に増殖因子刺激に依存しており、A431細胞においても血清の除去によりサイクリンD3の発現が低下し、また、EGFの添加によりサイクリンD3の発現が誘導された(図4A and B)。したがって、A431細胞でのサイクリンD3の発現は正常に制御されており、また、EGFによって誘導されることがわかった。次に、2DGおよびGlcN処理によってストレス応答したA431細胞について検討してみると、これらのストレスによりサイクリンD3の発現量が顕著に低下した(図4C)。このことから、ストレスによるEGFシグナルの遮断がG1期停止に直接関与していることが示唆された。

　GRP78/EGFレセプター複合形成と細胞周期のG1期停止との関係をさらに検証するため、ストレス条件下からのrelease実験を行った。2DG処理24時間後に培地交換しA431細胞をストレス環境下より解放すると、GRP78/EGFレセプター複合体は解離され、それに伴いEGFレセプターは徐々に170kDaの成熟型に変化していった(図5A)。EGFレセプターのチロシンリン酸化も回復し(図5B)、さらに、サイクリンD3の発現(図5C)も回復することが明らかになった。これらの変化に伴いG1/S ratioが低下し細胞周期のG1期からS期への進行が観察された(図5D)。

　ストレス応答したA431細胞において低糖鎖型のEGFレセプターが産生されることを見い出した。低糖鎖型EGFレセプターは、細胞膜上に発現せず、分子シャペロンGRP78と安定な複合体を形成し細胞内に存在することを明らかにした。GRP78/EGFレセプター複合体の形成は、G1期からS期の進行に重要なサイクリンD3の発現低下を導き、ストレス応答したA431細胞のG1期停止に関与することを示した。以上のことからストレスにより誘導されるGRP78は、EGFレセプターを細胞内にとどめ、EGFからサイクリンD3への増殖シグナルを遮断し、ストレス環境下でのA431細胞の増殖を制御していると考えられた。