HIVのgp120についての詳細な解析によりgp120には6つの-ヘリックス、1〜6が存在し、1,4,5,6はC1,C4,C6領域に2,3はV2とプセウドーC2領域に存在していることが報告されている。特に6-ヘリックス部位のアミノ酸配列の506から518番目にかけてNH₃⁺とグアニル基に由来するプラスチャージが連続する部位が存在し、これがポリアニオンである硫酸化糖と相互作用をする位置として推定されている。硫酸化多糖はgp120と結合することで物理的なリンパ球との接触阻害、あるいはgp120のコンホメーションを変化させることにより活性を発現していると考えられている。硫酸化物アニオンを持っているカードラン硫酸(平均分子量79,000,硫酸度1.5)とアンモンニウムカチオンを持っているポリリジン(平均分子量10,700)を種々の割合で混合したところ、そのイオン間の相互作用により高分子コンプレックスを形成することを見出した。高分子コンプレックスは両成分のモル比すなわちイオン比によって水にゲルの状態あるいは可溶性コンプレックスの状態で存在した。Fig.1と2にはカードラン硫酸とポリリジンとのモル比の変化による400MHz ¹H-NMRと100MHz ¹³C-NMRの測定結果を示した。Fig.1の(a)はカードラン硫酸、(b)はポリリジン、(c)〜(f)はカードラン硫酸とポリリジンのモル比が各々0.5、0.8、1.0、2.0で混合した試料の¹H-NMRスペクトルである。Fig.2の(a)はポリリジン、(b)〜(e)はカードラン硫酸とポリリジンのモル比が各々0.5、0.8、1.0、2.0で混合した際のそれぞれ試料の¹³C-NMRスペクトルである。¹H及び¹³C-NMRスペクトルではカードラン硫酸とポリリジン間でのイオン反応の生成物であるゲル状態のコンプレックスの含量に依存し有意に変化した。モル比が0.5の場合は未反応のポリリジンとゲル状態コンプレックスの共存状態、モル比0.8ではイオン比がほぼ1:1.2となり陰イオンと陽イオンとの結合によって生成されたゲル状態のコンプレックスのみが存在していることを示唆している。モル比1.0と2.0の場合は、ゲル状態のコンプレックスとフリー状態のポリリジンあるいは可溶性コンプレックスとの共存状態であることを示唆している。

Figure 1.400MHz ¹H NMR Spectra of curdlan sulfate(CS),poly-L-lysine(PL)and polyion complexes(PIC)between CS and PL at different molar ratios(CS/PL).

Figure 2.100MHz ¹³C NMR Spectra of poly-L-lysine(PL)and polyion complexes(PIC)between CS and PL at different molar ratios.

　カードラン硫酸とポリリジンの対イオンであるNa⁺及びBr^-イオンの元素分析結果によるとゲル状態のコンプレックスは透析前にもかかわらずNa⁺及びBr^-イオンは理論値に比べて16%程度しか存在していないことが分かった。更に、透析後にはNa⁺及びBrイオンが全く検出されなかった。この結果はゲル状態コンレックスがカードラン硫酸のとポリリジンのイオン間の静電気的な相互作用により生成されたことを強く支持している。

　高分子コンプレックスの形成は、モル比、濃度、pH、分子量、反応時間、温度等の影響を受けると考えられるのでそれらの条件を様々変化させてNMRを測定し、その結果をFig.3に示した。モル比0.8でゲル状態のコンプレックスの含量は最大になり、低い濃度でもほぼ同量のゲル状態のコンプレックスの形成が認められた。モル比0.67と1.0の場合ではゲル状態のコンプレックスの含量がイオン濃度に依存して増加した。モル比2.0ではゲル状態のコンプレックスは生成されなかった。これはカードラン硫酸の陰イオンの割合が多いために、コンプレックスが破壊されたと考えられる。(Fig.3a)カードラン硫酸の硫酸基は酸性下でも安定なアニオンの状態で存在しFig.3b示したようにモル比1.0の混合溶液でほぼ同量のゲル状態のコンプレックスが酸性から中性範囲で生成した。塩基性のpH範囲ではポリリジンのアンモニウム基の中和によりゲル状態のコンプレックスの生成は減少した。ゲル状態のコンプレックスはテトラマー以上の分子量のリジン化合物とのイオン反応により生成され、分子量が一万程度で最大になった。

Figure 3a.Dependence of the amount of gel-like complex on molar ratio and concentration.■:Molar ratio of 0.67.●:Molar ratio of 0.8.▲:Molar ratio of 1.0.◆:Molar ratio of 2.0.

Figure 3b.Dependence of the amount of gel-like complex on pH in the molar ratio of 1.0

　ヘパリンはマイクロ濃度で血奨中に存在するアンチトロンビンIII(AT-III)との静電気的な相互作用により,トロンビンを障害することが知られている。AT-III側のヘパリン結合部位はLys-282,Lys-286,Lys-289が考えられている。このようなイオン相互作用のモデル系であるヘパリンとポリリジン混合溶液の場合にもカードラン硫酸系のようにアンモンニウムカチオンを持っているポリリジンとのイオン間の相互作用により、高分子コンプレックスを形成することが分かった。更に¹Hと¹³C-NMRスペクトルでもカードラン硫酸系と同様にイオン反応の生成物であるゲル状態のコンプレックスの含量に依存し大きく変化した。Fig.4には分子量3,000のヘパリンと分子量8,000のポリリジンの混合溶液系で形成されたゲル状態の高分子コンプレックスのモル比、溶液のpHに対する依存性を示した。この溶液系ではモル比0.6でゲル状態の高分子コンプレックスの含量が最大になった。Fig.4に示すように,高分子コンプレックスの含量は反応系のpHに大きく依存した。酸性ではヘパリンのカルボキシル基の酸への変化、塩基性ではポリリジンのアンモンニウムカチオンのアミンへの変化によって高分子コンプレックスの形成が阻害されることが示唆された。ヘパリンとポリリジンの分子量による高分子コンプレックスの含量変化を調べたところ、ゲル状態の高分子コンプレックスは、リジン化合物の分子量が一万程度で最大になった。分子量が各々3,000,6,000と18,000のヘパリンを用いた場合、分子量が低いほど多量のゲル状態のコンプレックスが生成された。分子量6,000と18,000のヘパリンを用いた場合は反応温度及び時間を変化させることによってコンプレックス含量が増加した。(Fig.5)

Figure 4.Dependence of the amount of gel-like complex on pH in the molar ratio of 1.0

Figure 5.Dependence of the amount of gel-like complex on molecular weight of heparin.Mw of polylysine is 8,000.■:heparin 6,000.口:hcparin 6,000,incubation at 60C for 12hr.●:heparin 18,000.O:heparin 18,000,incubation at 60C for 12hr.

　コンドロイチン硫酸は長い鎖中に多数の負電荷イオン基を持ち、その電気的反発力のために延びたコイル状となる。この構造的特性により正に荷電した分子に親和性を示す。このような性質により弾性などの軟骨組織に特有な機能に関与すると同時に塩基性のII型コラーゲンと作用し機械的衝撃に耐える構造体を作ることが知られている。カードラン硫酸やヘパリンに比べて低い陰イオン性で活性を示すコンドロイチン硫酸につき、ポリリジンを用いてイオン間の相互作用を調べた。コンドロイチン硫酸とポリリジンの混合溶液の場合においても、カードラン硫酸系のようにアンモンニウムカチオンを持っているポリリジンとのイオン間の相互作用により高分子コンプレックスを形成することが分かった。コンドロイチン硫酸とポリリジンのモル比に対する高分子コンプレックス生成率をFig.7に示した。イオン比がほぼ1:1になるモル比である0.94〜1の間でゲル状態の高分子コンプレックスの含量が最大になった。カードラン硫酸とヘパリンが各々モル比0.8,0.6で最大の高分子コンプレックスを形成することを考えるとカードラン硫酸などの硫酸化多糖とポリリジンとの相互作用により生成された高分子コンプレックスはイオン比がほぼ1:1になるモル比で最大の疎水性を示していると考えられる。

Figure 6.Dependence of the amount of gel-like complex on molar ratio between chondroitin sulfate(CC) and polylysine(PL).

　異なる硫酸化度及びカルボキシル化度を有するカードラン硫酸、ヘパリン及びコンドロイチン硫酸とポリリジンの間にイオンコンプレックスが生成することを見出した。イオンコンプレックスの生成は種々の条件によって影響された。中でも、コンプレックスの溶解性は硫酸化多糖の親水性基の含量と密接な関係があった。ゲル状態のコンプレックスの量は陰イオンと陽イオンの比が1に近い場合に低濃度でも一定の量が生成されるが、それの以外の割合ではポリイオンの濃度に大きく依存した。また、ゲル化する割合は反応温度の上昇により増加することが分かった。このような結果から、ゲル状態のコンプレックスは硫酸化多糖とポリリジンの多官能相互作用により生成された架橋コンプレックス或いは一定の親水性/疎水性を示すコンプレックスの集合体であるとして考えられる。