硫酸基の導入位置の異なるカードラン硫酸を位置選択的に合成し、カードラン硫酸における硫酸基の位置と抗エイズウイルス活性及び抗凝血活性の関係を調べた。

　カードラン硫酸のすべての6位の水酸基と2位の一部の水酸基が硫酸化されたカードラン硫酸(62S)はScheme 1aで示す方法で合成した。分子量1万程度のカードラン硫酸を合成するために、硫酸化する前に、カードランを加水分解し、分子量(Mn)9.2x10³のカードランを得た。硫酸化の条件及び結果はTable 1に示した。カードランのすべての4位の水酸基と2位の一部の水酸基を硫酸基で置換したカードラン硫酸(42S)及びカードランの6位と4位と2位を部分的に硫酸化したカードラン硫酸(642S)はScheme 1bで示したように位置選択的保護と脱保護により合成した。硫酸化条件及び脱保護により得られたカードラン硫酸(42Sと642S)の結果をTable 1に示した。

Scheme 1.Synthetic route of regioselective sulfated curdlan(CS)a)CS having sulfate groups at all C6 and partial C2 positions(62S),b)CS having sulfate groups at all C4 and partial C2 positions(42S),and at partial C6,C4 and C2 positons(642S).

Table 1.Sulfation of Curdlan or 6-Pivaloyl Curdlan with SO₃-pyridine and Depivaloylation in NaOH Solution._a^aCudlan or 6-pvaloyl curdlan(1.0g)was sulfated in DMSO at room temperature.^bSO₃-pyridine complex was equivalent to glucose unit.^cThe number of sulfate groups per sugar unit in curdlan sulfate was determined by elemtal analysis.^dAssigned by combination of ¹³C NMR and elemental analysis.^eDetermined by GPC.^fDegree of pivaloylation.^gCurdlan was used.^hDegree of sulfation was negligibly small.ⁱExisting but difficult to calculate.

　位置選択的に合成した硫酸基の位置の異なるカードラン硫酸(62Sと42Sと642S)の抗エイズウイルス活性と硫酸化度及び硫酸基の位置との相関をFigure 1Aに示した。硫酸化度1.3以上で、50%感染阻害濃度EC₅₀＝0.04-0.4g/mlの高い抗エイズウイルス活性を示し、抗エイズウイルス活性が硫酸基の位置に依存せず、硫酸化度に依存することが分かった。カードラン硫酸の抗凝血活性の結果はFigure 1Bに示した。三酸化硫黄ピリジン錯体を用いて合成したカードラン硫酸はピペリジン硫酸場合より高い抗凝血活性を示すことが報告されたが、本研究で三酸化硫黄ピリジン錯体を用いて合成したカードラン硫酸は分子量が低いので、低い抗凝血活性(AA＝10-19unit/mg)を示した。一方、分子量が低いほど、抗凝血活性が線性的に減少する傾向が認められた。

Figure 1.(A) Dependence of the anti-HIV activity EC₅₀ of curdlan sulfate both degree of sulfation and position of sulfate groups(●42S,■62S and ▲642S)and(B)dependence of the anticoagulant activity of curdlan sulfate both molecular weight and position of sulfate groups(●42S,■62S and ▲642S).

　HIV感染では無症状のキャリアーの血液にはごくわずかのHIVしか検出されないが、この間も免疫系の破壊が続き、HIVはリンパ節で複製すると推定されている。一方はカードラン硫酸は長期間リンパ節に蓄積されることが我々のこれまでの研究により明らかになった。本研究ではAZTとカードラン硫酸を結合させ、カードラン硫酸をキャリアーとし、AZTをリンパ節に運搬できる可能性を持つAZT導入カードラン硫酸を合成し、In vittroでその抗エイズウイルス活性と抗凝血活性の評価を行った。

Scheme 2 Synthetic route of AZT-curdlan sulfate

　AZTを導入したカードラン硫酸誘導体はScheme2で示したルートで合成した。まず、無水コハク酸とAZTを反応させることにより、コハク酸AZTエステルを合成した、合成したコハク酸AZT-エステルとカードランを反応させると、カードランにAZTを導入することができた、導入率は0.15から0.50程度であり、生成物の構造は¹³C-NMRにより決定した。最後に、硫酸化を行い、カードラン硫酸-AZT誘導体を合成した。

　AZT-カードラン硫酸誘導体の抗エイズウイルス活性は種々の濃度のAZT-カードラン硫酸誘導体と共に感染直後のHIV-1感染細胞と非感染細胞を炭酸ガスインキュベーター中37℃で5日間培養し、MTT法によって生存細胞数を測定することにより評価した(山梨医大)。Table 2に、AZTを導入したカードラン硫酸の抗エイズウイルス活性と細胞毒性を示した。AZT-カードラン硫酸誘導体のEC₅₀は0.23-1.3g/mlの値を示した、In vitroではAZTはカードラン硫酸からリリースしていないと考えられるので、AZTの導入率が高くなると、AZT-カードラン硫酸誘導体の活性は低くなる傾向が認められた、カードラン硫酸としての活性は0.19-0.79g/mlの高い抗HIV活性を示した。また、カードラン硫酸の中にAZTを20%(mol/mol)導入しても、カードラン硫酸の活性の低下が見られないことが分かった。キャリアーとAZTとの間の結合の開裂は生体内での酵素分解によって起こることが期待されている。

Table 2.The Anti-HIV Activity of AZT-curdlan Sulfate Derivative^aDetermined by elemental analysis.^bDegree of suhstitution of sulfate group to glucose a unit.^cAnti-HIV activity;drug effective concentration for 50% inhibition of virus infection in 5-day HIV-infected MT-4 cell culture. ^dActivity of curdlan sulfate in AZT-curdlan sulfate derivate.^eCytotoxic effect:drug concentration 50% cytotoxicity in 5-day MT-4 cell culture.^fSelectivity index.^gSubstitution of AZT to a glucose unit.^hCurdlan sulfate having molecular weight of 7.9x10⁴ as a reference.

　AZT-カードラン硫酸誘導体のCC₅₀は1000g/ml以上の値を示し、AZTを50%導入しても、AZT-カードラン硫酸誘導体は細胞毒性を示さないことが分かった。

　AZT-カードラン硫酸誘導体の抗凝血活性をTable3に示した。AZTを導入したカードラン硫酸の抗凝血活性は16-18unit/mgであり、カードラン硫酸単独の場合とほぼ同じ活性を示した。AZTを導入してもカードラン硫酸誘導体の抗凝血活性が増加されないことが分かった。

Table 3.The Anticoagulant activity of AZT-curalan Sulfate Derivate^aDetermined by elemental analysis.^bDegree of substitution of sulfate group to glucose unit.^cAnticoagulant activity;Commercial dextran sulfate having 21 unit/mg as reference.^dSubstitution of AZT to glucose unit.

　目的 我々は高い抗エイズウイルス活性と低い細胞毒性を持ちながら、硫酸化多糖に比べ抗凝血活性低いの硫酸化アルキルオリゴ糖を研究してきた。硫酸化ドデシルラミナリペンタオシドは動物実験により半減期が8時間で、血液中に長時間持続できることが報告されている。AZTは体内で持続時間が短いため(半減期1時間)、AZTの体内持続時間を延長するために、本研究でマルトオリゴ糖を出発物質として、硫酸化アルキルオリゴ糖-AZTの誘導体の合成を検討した。

　Scheme3で示したようにAZT-硫酸化アルキルマルトオリゴ糖を合成した。マルトオリゴ糖は酢酸カリウム存在下、無水酢酸中で環流し、-アセチル体が優先的に生成するようにアセチル化を行った、結果はTable 4で示した、生成物の/比は6.06と6.36であった。塩化鉄(III)を触媒とし、トルエン中n-ドデシルアルコールとパ-アセチルマルトオリゴ糖を反応させることにより、パ-アセチルマルトオリゴ糖にアルキル鎖を導入した。収率は35%、生成物の構造は¹H-NMRにより確認した。これをメタノール中室温でナトリウムメトキシドで処理し、脱アセチル化体を得た。次にDMAP/DCCを触媒として用い、コハク酸AZTエステルとアルキルオリゴ糖を反応させ、アルキルオリゴ糖にAZTを導入した。最後に、硫酸化を行いAZT-硫酸化アルキルマルトオリゴ糖の誘導体を合成した。抗エイズウイルス活性の測定を行い、化学構造と生理活性の相関を調べた。

Table 4.Acetylation of Malto-oligosaccharides^aaReflux in acetic anhydride.^b-and -mixture.^cDeterminted by 1H NMR

Scheme3.Synthetic Route of Sulfated Alkyl Malto-oligosaccharides-AZT Derivative