cPLA₂のORF全長cDNAをプローブとして129/Svマウス由来ゲノムライブラリー(5×10⁵ pfu)をスクリーニングし、24クローンのファージを得た。解析の結果6つのエクソンが同定され、そのうちの1つは、リパーゼモチーフを含む137塩基対のエクソンであった。このエクソンの一部41塩基対をネオマイシン耐性遺伝子に置換することで、cPLA₂遺伝子の破壊を試みた。ターゲティングベクターは、上流、下流の相同配列として各4.1kbp、4.5kbpを持ち、さらにネガティブセレクションの目的でチミジンキナーゼ遺伝子を組み込んで作成した。

　7×10⁷個のE14-1マウスES細胞をcPLA₂ターゲティングベクターで電気穿孔法により形質転換し、G418、FIAU両耐性クローン576コロニーを得た。これらをサザンブロットで遺伝型を解析した結果、3クローンが相同組み換え体であることが明らかとなった。このうち2クローンの細胞をC57BL/6Jマウス胚盤胞に注入し、それぞれのクローンのキメラマウスを作成した。キメラマウスをC57BL/6Jマウスと交配してF1ヘテロマウスを得、さらにF1マウス同士を交配してcPLA₂欠損マウスを得た。

　マウスの遺伝型は、PCR法によって決定した。尾より抽出したゲノムDNA50-100ngをテンプレートとし、野性型、組み換えの各アリル特異的配列をprimerに用いることで3種類の遺伝型(野性型、ヘテロ、cPLA₂欠損)を判定した。一部のマウスについては、サザンブロット解析も行いPCRの結果と一致することを確認した。

　マウス脾臓より抽出したpolyA⁺RNAを用い、cPLA₂のORF全長cDNAをプローブとしてノザンブロット解析を行った。タンパク質レベルでの欠損を確認するため、マウス脾臓より細胞質画分を調整し、ウェスタンブロット解析とPLA₂活性の測定を行った。活性の測定は、2M[¹⁴C]アラキドノイルホスファチジルコリンを基質に用い、100mM Tris-HCl pH9.0、4mM CaCl₂、1mg/mlウシ血清アルブミン存在下に行った。

　9-14週齢の雌マウスに2mlの10%プロテオースペプトン水溶液を腹腔内投与し、4日後腹腔よりマクロファージを回収した。この細胞をカルシウムイオノフォアA23187(5M)または、リポポリサッカライド(LPS、1g/ml)で刺激し産生されるプロスタグランジンE₂(PGE₂)、システイニルロイコトリエン(Cys-LT)、PAFを定量した。PGE₂とCys-LTはA23187で10分、LPSで12時間の刺激を行い、培養上清中の量を酵素抗体法で測定した。PAFはA23187で10分、LPSで30分の刺激を行い、細胞と培養上清を合わせてラジオレセプター結合法にて測定した。

　10-12週齢の雄マウスに100g卵白アルブミン(OVA)を1mg水酸化アルミニウムゲルと300g百日咳毒素と共に腹腔内投与し、OVAに対する感作を行った。18日後、麻酔し人工換気下で頚静脈よりOVA 500gを投与してアナフィラキシーショックを惹起した。気道内圧と流量を測定し、総肺抵抗を算出した。OVA投与20分後、気道内圧が刺激前の水準に低下したのを確認し、メサコリン(アセチルコリンアゴニスト)エアロゾルを吸入させ気道の反応性を検査した。

　妊娠日数を特定する目的で、交配は一回一晩とし、一週間以上間隔をあけて施行した。メスマウスの体重を一日一回測定し、その変化から妊娠を確認、同時に妊娠日数を特定した。一部のマウスには、妊娠18.5日にプロゲステロンレセプターアンタゴニスト(RU486)を15mg/kgで皮下投与し、分娩の誘発を行った。

　2クローンの相同組み換え細胞とも、キメラマウスにおいて生殖細胞に分化させることに成功し、cPLA₂欠損マウスを作成することができた。cPLA₂欠損マウスはメンデルの法則に従った割合で誕生し、正常に発育する。脾臓を用いたノザンブロット、ウェスタンブロットにより、cPLA₂のmRNA、蛋白質レベルでの欠損を確認し、PLA₂活性も0.2±0.1pmol/min・mg proteinでありほぼ検出限界レベルに低下していた(野性型マウスでは11.3±1.0pmol/min・mg protein、mean±S.E.M.、n＝3)。生理活性脂質産生量では、腹腔マクロファージをA23187で刺激した際のPGE₂、Cys-LT、PAFの産生は顕著に減少しており、LPSで刺激したときのPGE₂の遅延型の産生もほとんど認められなかった。しかしながら、cPLA₂欠損マウスには外見上の異常は認められず、病理組織像では腎において尿細管上皮細胞の中程度の空胞化を認めた(5匹中3匹、4.5カ月齢)が、血液像・血液生化学検査いずれにおいても野性型マウスと顕著な違いを認めなかった。10ヵ月齢の段階でも外見上の異常は認められなかった。

　OVAによって惹起される能動アナフィラキシーにおいて、cPLA₂欠損マウスも野性型マウスと同様に15-20秒後より気道内圧の上昇が認められ、総肺抵抗においても2分を最大値とする気道収縮が認められた。最大抵抗値は、cPLA₂欠損マウスの方が若干小さかったが、有為な差は認められなかった(cPLA₂欠損マウス:184±27%、n＝5、野性型マウス:251±37%、n＝6、刺激前の抵抗値を100%とした)。総肺抵抗の回復はcPLA₂欠損マウスの方が早く、10分でほぼ刺激前の水準に低下した(野性型マウスは約150%)。OVA静脈投与後5-7分の肺の組織切片を鏡険したところ、野性型マウスでのみ気道収縮、肺胞壁の肥厚が認められた。メサコリンエアロゾルの吸入に対し、野性型マウスは過敏に反応して0.15mg/mlの濃度で気道収縮をきたしたが、cPLA₂欠損マウスでは同等の反応を得るために2.5mg/mlの濃度が必要であった。5-リポキシゲナーゼ欠損マウスにおいても同様の気道過敏性の消失が報告されており、喘息を初めとする気道過敏性を伴う呼吸器疾患において、cPLA₂がLTの産生を介して重要な役割を果たしていることを示唆している。

　生殖機能の面では、オスマウスは正常であった。それに対し、cPLA₂欠損メスマウスでは妊娠しコントロールマウスと同様の体重増加を示すが、通常の妊娠日数(19.5日)を過ぎても出産せず、子宮内胎児死亡をきたすことが多かった。19.5日の時点で帝王切開すると正常に発育した新生児が得られ、その後の発育も正常であった。また、cPLA₂欠損マウスはRU486によって分娩を誘発させることができ、産まれたマウスは正常に発育した。プロスタグランジン受容体欠損マウスも同様の表現型を示すことが報告されており、cPLA₂欠損メスマウスではの産生が低下していると推測され、その結果、分娩が遷延している可能性が示された。