アポトーシスに伴う脱アシル化反応にcPLA₂が関与する可能性を想定し解析したしかし、U937細胞中のcPLA₂活性は予想に反し、抗Fas抗体量依存的に減少した。また、アポトーシス細胞中のcPLA₂タンパクを抗ヒトcPLA₂ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより調べたところ、みかけの分子量が110kDaのインタクトなcPLA₂が消失し、78kDaのタンパクが出現した。この現象はアポトーシスの進行(死細胞率の増加およびDNAの断片化)に相関していた。また、抗ガン剤であるエトポシドによりU937細胞にアポトーシスを誘導した場合、あるいはヒト前骨髄急性白血病細胞株HL60細胞に抗Fas抗体またはエトポシド処理でアポトーシスを誘導した場合にも同様の現象が観察された。

　in vitro transcription/translation法で[³⁵S]Met標識cPLA₂を作製し、抗Fas抗体処理でアポトーシスを誘導したU937細胞のライセートと反応させた。その結果[³⁵S]cPLA₂のインタクトなバンドは細胞のライセート量あるいは反応時間依存的に減少し、78kDaタンパクが生成した(図1、左2列)。この変換はアポトーシスを誘導していない細胞のライセートでは観察されなかったことから、アポトーシスによりcPLA₂を限定分解するプロテアーゼ活性が細胞に誘導されることが示唆された。

図1 [³⁵S]Met標識cPLA₂を用いた限定分解検出系

　アポトーシスの進行に伴いCaspase Familyプロテアーゼが活性化される。[³⁵S]Met標識cPLA₂を用いた限定分解検出系で種々検討した結果、Caspas-3阻害剤が本反応を抑制した。そこで、細胞ライセート中のCaspase-3活性を測定したところ、抗Fas抗体処理3時間後より時間依存的に上昇し、cPLA₂限定分解の経時変化とよく相関していた。さらに、cPLA₂の522番目のアスパラギン酸周辺のアミノ酸配列に、これまで報告のあるCaspase-3が認識するコンセンサス配列のDXXDサイトが存在することに着目し、522番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変えたcPLA₂(D522N)を作製し、この変異cPLA₂がアポトーシスを誘導したU937細胞ライセートにより、限定分解されるか否かを調べた。その結果、変異cPLA₂は限定分解されなかった(図1、右2列)。また、523番目を終止コドンにかえたcPLA₂(1-522)を作製したところ、アポトーシスにより観察される78kDaのcPLA₂限定分解産物と同じ位置に泳動された。また、cPLA₂(1-522)を細胞に発現させたところcPLA₂活性は発現前と差が見られなかった。以上の結果よりcPLA₂上の522番目のアスパラギン酸がFas依存的なアポトーシスに伴い活性化されるCaspase-3による分解部位であると結論した。また、興味深いことにcPLA₂(1-522)は細胞質画分ではなく膜画分にすべて回収された。

　ヒト胎児腎細胞株293細胞における内在性cPLA₂の発現は検出限界以下であった。この細胞にインタクトなcPLA₂あるいはcPLA₂(D522N)の遺伝子を導入し、恒常的に発現した細胞株を樹立した。これらの細胞の成長に有意な差は見られなかった

　インタクトなcPLA₂とcPLA₂(D522N)の細胞活性化に伴うアラキドン酸遊離反応の差異を調べた。その結果、インタクトなcPLA₂が発現した細胞では予想通りカルシウムイオノフォアによる即時的刺激、またはIL-1と血清刺激による遅発的刺激の両者で有意なアラキドン酸遊離増強効果が観察されたが、cPLA₂(D522N)を発現した細胞ではどちらの刺激においてもアラキドン酸遊離は親株と差がなかった。しかし、cPLA₂(D522N)発現細胞のライセート中のcPLA₂活性は親株と較べて有意に増加していた。この結果から、cPLA₂のAsp⁵²²はアラキトン酸代謝過程でのcPLA₂機能発現に重要な役割を担うことを示唆している。

　(1)に示したようにアポトーシス細胞ではリゾリン脂質に再びアシル基が付加し、リン脂質に戻る再アシル化反応が亢進していると予想された(図2A)。実際、再アシル化酵素の1つであるアシルCoAリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、アポトーシス細胞では比活性が約3倍上昇していた。

図2 アポトーシスに伴うアシルCoA代謝関連酵素群の変動

　(1)に示したようにアポトーシス細胞ではグリセロリン脂質の脱アシル化反応が亢進していることから、本反応に既知のPLA₂アイソザイムが関与することを想定し、阻害剤の効果を検討したところ、カルシウム非依存性PLA₂の阻害剤で抑制された。しかし、(2)に示すcPLA₂を始め、既知のカルシウム依存性PLA₂の阻害剤は全く効果がなかった。また、PLA₂によらないアラキドン酸遊離経路として、図2Bに示すアシルCoA加水分解酵素に注目した。その結果、アポトーシス細胞では比活性が約2倍上昇しており、Acyl CoAの加水分解が亢進していた。また、逆反応であるアシルCoA合成酵素活性は、アポトーシス細胞では比活性が約4分の1に減少したことより、アポトーシスに伴いこの平衡反応は大きく右に傾いていることがわかった。