Ngrol遺伝子群にはこれまでにNgrolB、NgrolC遺伝子の配列が知られている。私は未解析部分の塩基配列決定を行った。その結果新しく3つのORFが見つかった。このうち2つはA.rhizogenesのRiORF13とRiORF14に高い相同性を示した。両遺伝子は真核生物の遺伝子の持つ転写、翻訳に重要な配列を有していることが示された。この遺伝子群をNgORF13、NgORF14と名付けた。残りのORFはNgORF14の下流に位置しミキモピン型のA.rhizogenesのもつ機能が未知のORFに高い相同性を示した。これらの結果はNgORF13とNgORF14が植物で発現、機能している可能性を示している。またNgrol遺伝子群の起源がミキモピン型のA.rhizogenesに系統的に近い菌からの感染導入であることを示唆している。

　第1章の結果よりNgrolB,NgrolC,NgORF13,NgORF14の4つのORFがN.glaucaゲノムに存在することがわかった。この領域に対応するRirol遺伝子群は毛状根の誘導に重要な役割を果たすことが知られている。Ngrol遺伝子群の転写をノーザンブロット解析により調べたところ、4つのORFすべてがN.glaucaの茎で発現していることが示された。次に遺伝子導入による毛状根誘導実験をN.tabacumとN.debneyiiの葉の切片で行った。RirolB,RirolC,RiORF13,RiORF14遺伝子群の導入では両者の葉に顕著な毛状根誘導が見られたのに対しNgrolB,NgrolC,NgORF13,NgORF14遺伝子群の導入では発根の誘導は観察されなかった。次にN.tabacumへの形質転換による植物個体の再生を行った。Rirol遺伝子群の導入では葉の湾曲、花の小型化など顕著な毛状根病徴が観察されたがNgrol遺伝子群導入植物はコントロールや野生型植物との形態の違いは観察されなかった。これらの結果はNgrol遺伝子群はRirol遺伝子群の持つ毛状根(病徴)の誘導能力を保持していないことを示唆している。

　NgrolとRirolのどの遺伝子によりこの様な違いが生じるのかを調べるため、予備実験としてまずRirol遺伝子群の個々の遺伝子の毛状根誘導に対する影響を調べた。RirolB,RirolC,RiORF13,RiORF14のうち1つのORFのみを制限酵素処理により破壊し残り3つの遺伝子による発根誘導実験を行った。その結果B+C+13そしてB+13+14では4遺伝子全てを導入したときと同じ毛状根誘導が観察された。B+C+14では発根誘導に若干の減少が観察された。ところがC+13+14では毛状根誘導が全く観察されなかった。RirolB遺伝子が毛状根誘導に最も重要であるというこの結果は以前に他の研究者らにより行われた結果と一致する。

　この結果によりNgrol遺伝子群のうちNgrolB遺伝子が毛状根誘導の機能を持っていないことが推測できた。そこでNgrolB遺伝子単独での導入を試みたところ毛状根誘導は観察されなかった。RirolB遺伝子単独では発根が示されたことから、両者の遺伝情報の違いがNgrol遺伝子群が機能を示さない原因であると考えられた。

　NgrolB遺伝子プロモーターの転写能力はRirolB遺伝子のそれと比べて1/2から1/3程度に低く抑えられていることが知られている。両遺伝子プロモーターの持つ転写制御能力の差が発根誘導の差を生む可能性が考えられたため、NgrolB、RirolB両遺伝子のプロモーター領域の交換を行った。結果は推測に反しプロモーターの交換は全く機能に影響しなかった。RirolBのORFの上流にNgrolBプロモーターをつけた融合遺伝子は自身のプロモーターを持つRirolB遺伝子と同様に発根が誘導された。一方NgrolBのORFの上流にRirolBプロモーターつけた融合遺伝子は毛状根誘導が観察されなかった。これらによりNgrolBプロモーターはRirolBプロモーターのもつ転写制御の情報が保存されていることが示唆された。

　これまでの結果からNgrolBとRirolBのORFの塩基配列の何らかの違いが機能の差を生み出していると考えられた。そこでNgrolBとRirolB遺伝子のアミノ酸配列を比較するとNgrolB遺伝子はRirolB遺伝子よりも早い段階で終止コドンがでてくるため48アミノ酸残基短いことが大きな特徴として浮かび上がった。このため予想される蛋白質の長さはRirolBが259アミノ酸残基なのに対しNgrolBは211アミノ酸残基となっている。NgrolBの開始コドンから633番目と723番目の塩基TをそれぞれCとGに置換することにより2つの終止コドンはRirolB遺伝子の対応するアミノ酸(アスパラギンとアスパラギン酸)になり48アミノ酸が回復する。そこでこの2塩基に対し部位特異的塩基置換を行いこのORFをNgrolB₂₁₂Q₂₄₂Eと名付けた。NgrolB₂₁₂Q₂₄₂Eを植物に導入したところ毛状根誘導の回復が観察された。発根の能力はRirolB遺伝子とほぼ同じ強さであった。この結果はNgrol遺伝子群をもつN.glaucaが毛状根病徴を示さないのは進化の途中におけるNgrolB遺伝子へのナンセンス点突然変異が原因であることを示唆している。

　NgrolB₂₁₂Q₂₄₂Eの機能をさらに詳しく探るためカリフラワーモザイクビールスの35Sプロモーター(P_35S)支配による強制発現を行った。P_35S-NgrolB₂₁₂Q₂₄₂E遺伝子を導入した再生植物個体は葉が上偏生長と湾曲を示し花が変形する異常形態が観察された。これらの形態変化は子孫に遺伝し、形態異常植物にはNgrolB₂₁₂Q₂₄₂Eの転写が強く観察された。P_35S-RirolB形質転換植物にみられる丸い葉や早い段階での壊死などの性質はP_35S-NgrolB₂₁₂Q₂₄₂Eでは観察されなかった。またP_35S-NgrolB形質転換植物には形態の変化は観察されなかった。

　NgrolC,NgORF13,NgORF14遺伝子群について機能の解析を行った。第2章の途中結果よりRirolC,RiORF13,RiORF14領域にはRirolB遺伝子の発根誘導を促進する働きがあることがわかっている。はじめにNgrolC,NgORF13,NgORF14領域にも同様の働きがあるのかを調べた。実験はRirolB遺伝子とNgrolC,NgORF13,NgORF14遺伝子群を1つの遺伝子導入ベクターに同時にくみこんだプラスミドを作成し、植物に導入することにより行った。その結果NgrolC,NgORF13,NgORF14領域にもRirolB遺伝子の発根誘導を促進する能力が保持されていることが示された。次にこの促進能力が3つのどの遺伝子に由来するのかを調べるため遺伝子群をさらに細かく区切り、RirolB遺伝子とともに植物に導入した。その結果、発根誘導の促進はNgORF13遺伝子のみのRirolB遺伝子との同時導入で十分に観察されることがわかった。NgORF14遺伝子にも弱い促進が観察された。RiORF13,RiORF14遺伝子を使ったコントロールの実験はNgORF13,NgORF14遺伝子と同じ結果を示した。

　つぎにP_35Sにより強制発現を行って遺伝子の機能を特徴だたせ観察した。P_35S-NgrolC形質転換植物は葉が細くなり節間長が減少し、また花の小型化や雄性不稔が観察された。これはP_35S-RirolC導入植物に見られた性質と同じであった。P_35S-NgORF13形質転換植物では葉が逆に丸くなった。萼、花弁、雄しべ、雌しべの花葉でも同様に縦方向の伸長抑制が観察された。実験の結果はNgrolC,NgORF13遺伝子がA.rhizogenesのRirolC,RiORF13遺伝子と同じ働きをなしうる配列を現在も保持していることを示している。NgrolC,NgORF13,NgORF14遺伝子はN.glaucaで転写することが示されている(第2章)。Ngrol遺伝子群のいくつかの遺伝子はN.glaucaの進化の間その機能を保持し続けたと考えられる。