ツメガエル胞胚の予定外胚葉片(0.3×0.3mm)を、10ng/mlアクチビンAと10^-4Mレチノイン酸で処理したとき、前腎管が非常に高頻度(100%)でかつ特異的に誘導されるということが明らかになった。アクチビンA単独で予定外胚葉片に処理すると、筋肉を中心とした中軸中胚葉が形成される。それとは対照的に、胚の後方化や側方化を引き起こさせるレチノイン酸単独で予定外胚葉片に処理しても、特定の誘導は引き起こされない。しかし、両方で同時に処理すると、側板中胚葉由来である前腎管が誘導されるということは、アクチビンAにより誘導された背側中胚葉がレチノイン酸により後方ないし側方化された結果であるということを示唆している。

　前腎では筋肉や神経のような分化マーカーがいまだに定義されていない。そこで、前腎の分化マーカーを既存の遺伝子より任意に設定し、その発現様式を解析した。前腎マーカー遺伝子として、Xlim-1とXlcaax-1を選択し、それぞれの遺伝子の発現パターンを解析した。その結果、この2つの遺伝子は、正常発生の異なる時期に前腎の細胞系譜で発現され、その発現パターンよりXlim-1は腎管形成の初期マーカー遺伝子として、Xlcaax-1は後期マーカー遺伝子として利用でき、2つの遺伝子を組み合わせて用いることにより腎管形成過程を追跡することが可能であるということが示唆された。そこで、外植体に誘導された前腎管が、遺伝子の発現レベルでも正常胚の前腎管と同様の過程を経て形成されているのかを調べるために、ここで設定した2つの前腎マーカー遺伝子(Xlim-1,Xlcaax-1)の発現様式を解析した。その結果、外植体に誘導された前腎管は、正常胚の前腎管と同様に、適時適所でこれら2つのマーカー遺伝子を発現しているということが明らかになった。この結果より、外植体に誘導された前腎管は、その形成の初期過程から正常胚と同様の遺伝子発現を行っており、分子レベルでも正常胚の前腎管の発生と並行して進んでいるということが示唆された。

　Na⁺-K⁺-ATPaseは、腎臓における塩や水分の再吸収や、膜を介して細胞内外に形成される電気的勾配の調整において重要な役割を担っている。また、胚発生中にも、胞胚腔や神経管の形成においても重要な役割を担うことが報告されている。このNa⁺-K⁺-ATPase a subunitのツメガエル胚における発現様式をwhole-mount in situhybridization法により解析した。その結果、Na⁺-K⁺-ATPase a subunitは、原腸胚期には原口の背側域で、神経胚期には神経管全域にて、尾芽胚期には前腎及び総排泄口にて、おもに発現していることが明らかになった。

　外植体に誘導された前腎管が、正常胚と同様の過程を経て発生するばかりではなく、正常胚と同様に機能しうるかどうかを調べるために、前腎の機能タンパクの一つであるNa⁺-K⁺-ATPase a subunitの発現様式をwhole-mount in situ hybridization法により解析した。その結果、外植体に誘導された前腎管は正常胚と同様の時期から前腎管での発現を開始することが明らかになった。

　Na⁺-K⁺-ATPaseの胚発生中における役割を調べるために、Na⁺-K⁺-ATPase a subunitのアンチセンスRNAをツメガエル初期胚に顕微注入した。その結果、胚には著しい陥入阻害が確認された。また、特に背側に顕微注入した場合には、胚の頭部の形成が阻害された。これらの結果は、Na⁺-K⁺-ATPaseが原腸陥入や頭部の形成おいて重要な役割を担っていることを示唆している。

　10ng/mlアクチビンAと10^-4Mレチノイン酸で処理した外植体で発現し、腎形成に関与している遺伝子を単離するために、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法によるクローニングを行った。クローニング用のライブラリーとしてはSt.15〜34の胚由来のcDNAライブラリーを作製した。また、プローブとしては、処理後24時間培養した外植体由来のcDNAプローブと、St.6の胚由来のcDNAプローブを準備した。これらのプローブを用いて実験を行った結果、前腎形成のある一時期にのみ前腎域で発現する遺伝子がクローニングされた。この遺伝子の全配列を決定し配列検索を行った結果、マウスのcold-inducible RNA binding protein(CIRP)とアミノ酸配列で75%の相同性を持つことが明らかになった。さらに、whole-mount in situhybridization法により発現領域を調べたところ、この遺伝子は前腎管や神経組織形成の中期に一過的に前腎域あるいは神経域で発現していた。

　本研究では、ツメガエル予定外胚葉片をアクチビンとレチノイン酸という2つの誘導因子で処理することにより前腎管を特異的かつ高頻度に誘導し、この前腎管を正常胚の前腎管と比較し、さらに、この誘導系をもちいて前腎形成関連遺伝子のクローニングを行った。アクチビン単独では、予定外胚葉片からは前腎は誘導されないが、これにレチノイン酸を加えると前腎管が非常に高頻度に誘導された。このことは、アクチビンの誘導特異性をレチノイン酸が修飾していることを示唆している。このメカニズムについては不明な点が多く今後さらに検討を要するであろう。また、腎形成のメカニズムをより理解するためには、腎形成に関わる遺伝子群を単離することも重要な作業となる。今回クローニングされた遺伝子は、腎形成の一時期に一過的に発現しているという点では重要であるが、前腎の誘導には関わっていない。今後さらなるクローニングにより前腎形成の初期に関わる遺伝子の単離をおこなうことが重要となるだろう。しかしながら、本研究はこれまで困難とされてきた、精製された物質による腎臓の誘導をおこない、人工的に本来の機能を有する組織の誘導を可能にした。この実験系を利用することにより、腎臓を分子レベルで解析することも可能である。このように本研究によりえられた成果は、腎臓の発生分化の過程を組織学的および分子生物学的に解析する上で有効な実験系となるであろう。