電離・非電離放射線は、細胞の遺伝情報を担うDNAに種々の傷害を与え、細胞死、変異、ガン化などを引き起こす。X線に代表される電離放射線の場合、DNAの2重鎖切断がこれらの放射線生物学的現象の担い手であると考えられ、細胞は様々な方法でDNA2重鎖切断を修復する。また、細胞は放射線に応答して、G1/S期やG2/M期における細胞周期進行の停止やアポトーシスによる細胞死などを起こす。

　DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)は、触媒サブユニットDNA-PKcsとKu抗原ヘテロダイマーKu86およびKu70の3つのポリペプチドから構成されるプロテインキナーゼである。DNA-PKの活性化には2本鎖DNAへの結合が必要であり、また、DNA-PKはp53、Replication protein A(RPA)をはじめとする数多くの核タンパク質をリン酸化する。近年、DNA-PKの3つのサブユニットのうち、DNA-PKcsがV(D)J組換えに欠陥があり、放射線に高感受性を示すマウスscid(severe combined immunodeficiency)変異の原因遺伝子であることが報告された。また、p85がXRCC5(X-ray repair cross-complementing)遺伝子産物であり、いくつかの電離放射線感受性変異細胞で欠損していることが報告された。これらのことから、DNA-PKはDNA2重鎖切断の認識や再結合において、重要な役割を担う酵素である可能性が示唆される。

　本研究では、まず、ヒト白血病由来MOLT-4細胞核抽出液から、DEAE陰イオン交換カラム2回とDNA-celluloseカラムの計3段階のカラムクロマトグラフィーにより、DNA-PKを精製した。精製したDNA-PK画分は、これまでHeLaおよびRaji細胞から精製が報告されたものと同様に、470kDa、86kDa、70kDaの3本のメインバンドを含んでいた(図1)。470kDa、86kDa、70kDaのバンドはそれぞれ、DNA-PKcs、Ku86、Ku70に対する抗体に反応した。更に、精製DNA-PKをグリセロール濃度勾配中で超遠心することにより、DNA-PKcsとKuサブユニットに分離した。超遠心後の各画分についてリン酸化活性を検討したところ、リン酸化活性はDNA-PKcs画分に顕著に見られた(図2)。リン酸化活性はKu画分のみではほとんど見られなかったが、DNA-PKcsにKuを加えることによりリン酸化活性が促進された(図3)。このことから、DNA-PKcsがリン酸化触媒活性を持ち、Kuサブユニットはこれを増強する役割があることが判明した。

図1.MOLT-4細胞のDNA-PKのDNA-celluloseカラムクロマトグラフィーにおける挙動。A.溶出画分の-カゼインリン酸化活性。B.SDS-PAGEパターン。

図2.グリセロール濃度勾配中での遠心によるDNA-PKcsとKuサブユニットの分離。A.SDS-PAGEパターン。B.合成ペプチドリン酸化活性。

図3.分離したDNA-PKcsとKuサブユニットを再混合した場合のDNA-PK活性。

　精製したDNA-PKホロ酵素と、分離したサブユニットに対する44℃温熱処理の影響を調べた。まず、DNA-PKホロ酵素を37℃または44℃で処理した後の活性を測定した。44℃では5分間処理から活性の低下が見られたが、37℃では30分間処理してもほとんど活性が低下しなかった(図4)。次に、分離したサブユニットの44℃温熱処理感受性を調べるため、p470画分とKu画分を別々に37℃あるいは44℃で処理した後、両者を混ぜ合わせてリン酸化活性を測定した(図5)。44℃処理したKuと37℃処理したp470を混ぜ合わせたとき活性は、37℃処理したKuと37℃処理したp470を混ぜ合わせたときより顕著に低下していた。一方、37℃処理したKuと44℃処理したp470を混ぜ合わせたときの活性は37℃処理したKuと37℃処理したp470を混ぜ合わせたときとほとんど変わらなかった。更に、44℃処理したKuと44℃処理したp470を混ぜ合わせたときの活性は、44℃処理したKuと37℃処理したp470を混ぜ合わせたときの活性とほぼ同じであった。以上から、DNA-PKは44℃温熱処理に対して不安定であり、Kuサブユニットが温熱不安定性の原因であることが示唆された。

図4.精製DNA-PKホロ酵素を37℃(○)、44℃(●)で各時間前処理した後のリン酸化活性。

図5.DNA-PKcsとKuを別々に37℃、44℃で前処理後再混合した場合のリン酸化活性。

　細胞内のDNA-PKの温熱安定性を調べるために、44℃でさまざまな時間処理した細胞から粗抽出液を調製し、DNA-PK活性を測定した。調べた8種類の細胞のうち、3種類のげっ歯類細胞(V79、FM3A、FSA)では、60分以内の温熱処理で、DNA-PK活性が3分の1あるいはそれ以下に低下した。一方、5種類のヒト細胞(MOLT-4、U937、HL60、MKN-45、A7)は、60分処理までの温熱処理後も未処理のものとほとんど同等のDNA-PK活性を示し、180分処理後においても40%以上の活性を維持していた。これらの結果から、DNA-PKはげっ歯類細胞内で温熱処理に対して不安定であるが、ヒト細胞内では安定であることが示唆された。

　温熱処理はがん治療に、しばしば放射線と組み合わせて用いられる。温熱処理と放射線を組み合わせる生物学的意義としては、放射線感受性が低いS期細胞が温熱処理に高感受性であること、そして、放射線によって生じた細胞傷害の修復能力が温熱処理によって低下することが挙げられる。DNA切断は放射線によって生じる細胞傷害の中で最も致命的なものと考えられることから、温熱処理による放射線増感作用はDNA切断の修復酵素の不活性化によるところが大きいと考えられている。一方、最近になっていくつかの放射線感受性細胞でDNA-PKのサブユニットが欠損していることが示され、DNA-PKが放射線で生じたDNA傷害、とくに2重鎖切断の認識や修復に重要な役割を担う酵素であることが強く示唆されている。また、一般的にヒト細胞の温熱による放射線増感効果がげっ歯類細胞に比べて小さいという報告がこれまでにいくつかあるが、本研究で、DNA-PKはげっ歯類細胞内で温熱処理に対して不安定であるが、ヒト細胞内では安定であることを示した。これらのことを考え合わせ、本研究で示したDNA-PK、特にそのKuサブユニットの温熱不安定性は、放射線によって生じた2重鎖切断の認識や修復の傷害を介して、温熱処理による放射線増感作用の原因の1つとなっている可能性が示唆された。