花冠長50mm以上のホタルブクロの花をL、50mm未満のものをM、シマホタルブクロをSとし、以下のような実験集団を設定した(図1)。1995年(12集団):栽培株3個体(各1花、♂のL・M・S)と野生株1個体(3または4花、♀でサイズは不定)。1996年(8集団):栽培株4個体(各1花、♂のL・Mと♀のL・M)。♂・♀の花ともに1日目の新鮮な花を用いた。実験以外の訪花を防ぐため、実験までは栽培株は温室内におき、野生株は袋かけをしておいた。各個体は父性解析が可能なように選択した。栽培株は均等に配置し、地表からの高さも一定に保った。栽培株の花については花冠長と花冠幅をあらかじめ測定しておいた。花粉の混入を防ぐために、周囲50m以内に開花している野生株は実験開始前にすべて除雄した。この集団を3〜4時間のあいだ野生のトラマルハナバチに訪花させた。実験後、♀の花は袋かけをし、果実が熟した後に種子を栽培して父性解析に用いた。♂花の葯は回収し、初期花粉数の推定に用いた。

　種子の花粉親は電気泳動度に多型のある5酵素、PGM・PGI・SKD・LAP・AATの遺伝子型によって同定した。初期花粉数は葯長への回帰によって推定したが、この推定残差が花冠長・花冠幅と無相関であることを確認した。重回帰分析の説明変数としては、♀の繁殖成功に関しては花冠長・花冠幅・実験時間・実験年を、♂の繁殖成功に関してはこれらに初期花粉数を加えたものを用いた。グループSのシマホタルブクロは、花サイズ以外にも和合性などに明らかな違いがあることを考慮して解析には用いなかった。

　60♀花/20集団のうち成熟した34果実/17集団の種子を解析した。その結果、実験集団外からの花粉の混入によると考えられる種子も少数の果実で見出された。このような果実を含む3集団を除き、28果実/14集団について繁殖成功を推定した。♂花間での比較では、28果実中21果実でLの花粉による種子が最多であった。また、95年度に解析した448種子中、シマホタルブクロが父親であったものは12種子(2.6%)であった。

　重回帰分析の結果、♂の繁殖成功は花冠幅と正の有意な偏相関を示した(表1)。すなわち、花冠幅が広い花ほど雄性繁殖成功が大きいという傾向がみられた(図2)。この偏相関は各年度ごとでも統計的に有意であり、また♀の花冠幅とも無関係であった。一方、♀の繁殖成功は花冠長・花冠幅のいずれとも有意な偏相関を示さなかった(表1)。

　これらの結果は花冠幅に対する正の選択圧の存在を示す。ハナバチ媒花の広い花筒を維持するような選択圧が実験的に示されたのはこれがはじめてである。この選択圧は、花の雄機能を通じたものであった。

　上記(1)の実験集団での送粉実験で、送粉者の飛来ごとに訪花の順序と各花での滞在時間を記録した。このデータから、各♂花ごとに被訪花率(飛来あたりの訪花数)と平均訪花順位(飛来後の一連の訪花の中での順位の平均)を求めた。また、実験後に♂花の花柱を回収して残存花粉数を測定し、初期花粉数との差として花粉搬出数を推定した。被訪花率・平均訪花順位・花粉搬出数の3変数を、花冠長・花冠幅・初期花粉数・実験時間・実験年の5変数を説明変数として、重回帰分析した。滞在時間については説明変数から実験時間を除外し、同一の花への異なる訪花での滞在時間を繰り返し測定として分析した。

　花粉の授精能力をLとSで比較するために次の実験を11セットおこなった。LとSの新鮮な♂各1花からすべての花粉を回収し、十分に混合した後に新鮮な♀に人工授粉した。上記(1)と同様に授粉花粉数(＝初期花粉数)の推定および父性解析を行い、各♂の授精能力を示す変数として繁殖成功/授粉花粉数を求めた。人工授粉実験における各♂の「繁殖成功/授粉花粉数」と送粉実験における各♂の「繁殖成功/搬出花粉数」をそれぞれ、花冠長・花冠幅・初期花粉数・実験時間・実験年の5変数を説明変数として重回帰分析し、両者の偏回帰係数に有意な差があるかどうかを検定した。さらに、花冠幅との有意な相関が見出された被訪花率を第6の説明変数として繁殖成功を重回帰分析した。

　被訪花率は花冠幅と、滞在時間は花冠長と、花粉搬出数は初期花粉数と有意な正の相関を示した(表1)。また、送粉実験での各♂の繁殖成功/花粉搬出数は、繁殖成功と同様に花冠幅と有意な偏相関を示した。この偏相関は被訪花率によっては説明されなかった。この結果は、花冠幅への選択圧が花粉搬出以後の段階に働くことを示す。

　一方、人工授粉実験での各♂の繁殖成功/授粉花粉数は花冠長・花冠幅・初期花粉数のいずれとも有意な相関を示さなかった。そして、繁殖成功/花粉搬出数と繁殖成功/授粉花粉数の花冠幅への偏回帰係数には有意差がみとめられた(表1)。この結果は、花冠幅への選択圧が花粉の柱頭到達以前の段階に働くことを示す。

　したがって花冠幅への選択圧は、花粉の花からの搬出から柱頭への到達までの間の段階に働いている。この段階に働く選択圧はこれまで知るれていないが、この結果から、花粉搬出数は雄性繁殖成功の推定値としては不適切であると言える。この選択圧の働く機構としては、花粉の落下率を減らしマルハナバチへの花粉の付着率を増加させるという可能性が考えられる。

　野外集団においてマルハナバチの訪花時に、落下した花粉およびマルハナバチに付着した花粉を回収し、その数を測定した。それぞれについて花冠長・花冠幅・初期花粉数・開花後の日数とマルハナバチの滞在時間を説明変数とする重回帰分析をおこない、偏回帰係数の差を検定した。

　花粉落下数は花冠幅と負の、滞在時間・開花後の日数と正の、それぞれ有意な偏相関を示した。すなわち、花冠幅が広いほど花粉落下数は減少した。一方、花粉付着数は花冠長と負の、滞在時間と正の有意な偏相関を示した。しかし花冠幅との偏相関は有意でなく、花冠幅と両者との偏相関には有意な差がみとめられた(図3)。

　この結果を用いて、花粉の付着率(花粉付着数/花粉搬出数)は花冠幅が広いほど増加することが明らかになった。花冠幅による花粉付着率の変動は、およそ2倍と推定された。したがって、広い花筒の機能の少なくとも一部は、花粉付着率を増加させることであると考えられる。

　花冠幅が広いときに花粉落下数が減少することは、マルハナバチと花粉の接触がゆるやかになることで説明できる。広い花筒を持つハナバチ媒花は多くの場合、花筒の広さによってハナバチと花粉との接触がゆるやかになるような形態である。このことは、本研究で見出された花粉付着率の増加という機能が、一般のハナバチ媒花においても広い花筒を進化させた可能性を示唆する。