ミトコンドリア核の構造による複製と転写の制御機構をin vitroで解析するためには、in vivoの構造かつ機能を保持した単離ミトコンドリア核の単離が必要である。変形体をもちいた構造的に無傷なミトコンドリア核の単離は、鈴木ら(1982)によって報告されていた。そこで、変形体のミトコンドリア核内におけるDNA複製様式を解析した。チミジンのアナログであるBrdUを変形体に1時間取り込ませた後、抗BrdU抗体とFITC標識した2次抗体を用いた抗体染色によりDNA合成部位の局在を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、DNAの合成部位はミトコンドリア核の長軸方向に沿って数カ所、点状の輝点として観察され(図3)、変形体においても、輝点の数はミトコンドリア核のDNA含量に比例し、mtDNA約10分子につき1個の輝点が検出される計算になった(図4)。以上のことから、変形体においてもMRCを単位とする複製が行われていることがわかった。さらに、変形体のミトコンドリア核に対しても、ミトコンドリア膜と結合するmtDNAの配列(membrane binding region,MBR)をプローブとしてFISH(fluorescence in situ hybridization)を行った。その結果、MBRはミトコンドリア核の長軸方向に沿って数カ所、点状の輝点として観察された(図5)。このことは、MBRはミトコンドリア核内でクラスターをつくっていることを示している。また、そのMBRのクラスター数はミトコンドリア核のDNA量に比例し、mtDNA10分子につき、一個のクラスターが検出される計算になった(図6)。このことは、変形体でもmtDNAが約10分子ごとにクラスターをつくってミトコンドリアの膜系に結合していることを示している。

　鈴木らの方法により単離されたミトコンドリア核画分には細胞核の混入がみられた。このことは、今後の生化学的解析に支障をきたす。そこで、パーコールを用いた超遠心によりミトコンドリアを精製した(図7a-e)。単離ミトコンドリア核は、精製されたミトコンドリアを界面活性剤であるNonidet P-40(NP-40)で膜を可溶化することで得られる(図7f-g)。一般に、膜の可溶化の度合いは、界面活性剤と膜成分の量比により変化し、界面活性剤の濃度を固定した場合には膜タンパク質量が高いほど膜は可溶化されなくなる。そこで、NP-40(0.5%)で処理するミトコンドリアの濃度を変化させ、ミトコンドリア核の単離条件を検討した。電子顕微鏡観察により、高濃度のミトコンドリア(4.5g mitichindrial protein/l)を処理して得られたミトコンドリア核(A)には膜断片が付着おり、低濃度のミトコンドリア(0.15g mitichindrial protein/l)を処理して得られたミトコンドリア核(B)には膜が付着していないことが示唆された(図8)。また膜マーカー酵素活性の測定により、単離ミトコンドリア核には内膜のみが残存しており前者は後者と比較して約20倍の内膜が残存していた。以上の結果から、NP-40処理する際のミトコンドリア濃度は内膜の可溶化に影響することがわかった。さらに、単離ミトコンドリア核のDNA合成とRNA合成に関する解析により、NP-40処理する際のミトコンドリア濃度は、RNA合成活性には影響しないが、DNA合成活性には影響することがわかった(図9)。その際、単離ミトコンドリア核(A)のDNA合成活性は単離ミトコンドリアとほぼ同様であったが、単離ミトコンドリア核(B)は20%の活性しか示さなかった。ゲル内アッセイ法を用いてそれぞれの単離ミトコンドリア核に含まれるDNAポリメラーゼの量を比較した結果、単離ミトコンドリア核(A)は単離ミトコンドリアとほぼ同量のDNAポリメラーゼを含んでいたが、単離ミトコンドリア核(B)はDNAポリメラーゼ量が減少していた(図10)。このことは、DNA合成活性の低下は、単離ミトコンドリア核内のDNAポリメラーゼ量の減少によることを示唆している。

　次に単離ミトコンドリア核(A)がin vivoの構造と機能を反映しているかを解析した。対数増殖期と定常期の細胞から単離したミトコンドリア核(A)のDNA合成活性を測定した結果、in vivoと同様に、定常期と比較して対数増殖期の方が約3〜4倍高い活性を示した。また、あらかじめBrdU処理した変形体から単離したミトコンドリア核を抗体染色した結果、単離ミトコンドリア核はMRC構造も保持していた(図11)。また、BrdUTP存在下でDNA合成反応を行わせ抗体染色を行いDNA合成部位を観察したところ、単離ミトコンドリアおよび単離ミトコンドリア核ともに、MRCを単位とするDNA合成を行っていた(図12)。以上のことは、単離ミトコンドリア核(A)はin vivoの構造と機能を反映しており、構造と機能に関するin vitroの解析に適していることを示している。

　DNAの高次構造と機能に重要であるミトコンドリアの核タンパク質を同定するために、NaCl処理により単離ミトコンドリア核(A)の高次構造を解体し、その時に機能が変化するか、またその時にどのようなタンパク質が遊離してくるかを解析した。単離ミトコンドリア核は、0.1MのNaCl処理により、平均10分子のmtDNAを含む小塊へと断片化し、0.2Mでは平均4分子のmtDNAを含む小塊へと断片化した(図13)。また、0.5Mでは、DNAの折り畳みがゆるんだ。また、DNA合成活性の低下は0.2Mで、RNA合成活性の低下は0.5Mで見られた。SDS-PAGEで解析した結果、0.2Mでミトコンドリア核の主要構成タンパク質である41kDaが遊離してきた(図14)。サウスウエスタン解析の結果、41kDaタンパク質はDNA結合能を保持していた(図15)。N末端アミノ酸配列及び内部ペプチドマップを作成しC末端側アミノ酸配列を調べた結果、41kDaタンパク質は新規タンパク質であった。41kDaタンパク質の遺伝子を決定するために、アミノ酸配列からdegenerated primerを作製し、total DNAを用いてPCRを行った(図16A)。その結果、617kbpのDNA断片が増幅され、41KDaタンパク質の一部であろう205アミノ酸をコードする領域を推定した(図16B)。アミノ酸配列から41KDaタンパク質はリジンが多く、ホモロジー検索の結果、トリバノゾーマの細胞核ヒストンH1に類似していた。また、増幅してきたDNA断片をプローブにしたサザンハイブリダイゼーションは、41kDaタンパク質の遺伝子がゲノム中に一つ存在することを示唆した。さらに、41kDaタンパク質の抗体を作製しウエスタン解析をした結果、41kDaタンパク質は細胞核にはなく、ミトコンドリア核に多く局在していた(図17)。