Cyanidiumの細胞では分裂の進行に伴い、まず色素体が分裂し、次いで細胞核・ミトコンドリアの順で分裂して2つの内生胞子を形成する。これと同様の分裂をもう1回繰り返すことにより、4つの内生胞子を形成して増殖する(図1)。この過程に収縮リングが関与しているか否かを明らかにするために、様々な分裂段階の細胞をDAPIとFITC-ファロイジンで2重染色して観察した(図2)。間期にはアクチンからなる構造物は観察されなかったが、分裂中の細胞では分裂面に収縮リングが観察された。収縮に伴うリング中のアクチン量の変化を明らかにするために、収縮リング部分のFITCの蛍光強度を顕微蛍光測光装置で定量した(図3)。分裂の開始と終了時では蛍光強度にほとんど差がみられないことから、一度形成されたアクチンのリングは脱重合せずにそのまま収縮することがわかった。

　従来の研究では収縮リングの収縮過程に主眼が置かれており、主成分であるアクチンの遺伝子発現やリングの構築過程が注目されることはなかった。しかし、アクチンからなる主要な構造物が収縮リング以外に存在しないCyanidiumならは、これらの初期過程の解析も可能であると思われる。そこで、Cyanidiumのアクチン遺伝子を単離した。既に単離してある近縁のCyanidioschyzon merolaeのアクチン遺伝子(Takahashi et al.,1995)をプローブにしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、Pst1処理した場合には5.0kbpの位置にバンドが検出された。そこで、5.0kbp付近のPst1断片をゲルから回収し、プラスミドベクターpBluescriptにクローニングしてライブラリーを作成した。スクリーニングの結果、制限酵素地図がわずかに異なる2つのアクチン遺伝子を得た(act1.act2;図4)。共に1137bpからなるORFが見つかったが、両者では9塩基が異なっていた。しかし、これらは全てコドンの3文字目に位置しており、推定アミノ酸配列は同一であった。act1とact2をプローブにした弱い条件下のサザンハイブリダイゼーションの結果、Cyanidiumにはアクチン遺伝子が2つしか存在しないことがわかった。act1とact2はともに17番染色体上に存在していた。転写されるmRNAの大きさは1.5kbであった。

　細胞内のアクチンの局在を明らかにするには抗アクチン抗体が必要である。そこでact1遺伝子を発現ベクターpQEにクローニングし、大腸菌内で過剰発現させた融合タンパク質を用いて抗体を作成した。ウエスタンブロッティングでは43kDaの位置に単一のバンドが検出され、推定分子量42kDaとよい一致を示した。この抗体を用いて間接蛍光抗体染色を行った(図5)。間期には細胞質に多数のアクチンドットが観察された。細胞質分裂に先立ちアクチンドットが赤道面に一列に並び、これらをつなぎ合わせるようにして収縮リングが形成された。収縮リングの収縮が始まるとアクチンドットは細胞質から消失し、分裂が完了すると再び細胞質に現れた。従って、これらのアクチンドットは収縮リングの形成に関与していると思われる。

　分裂に伴う細胞内構造の変化をより詳細に観察するためには、電子顕微鏡による観察が必要である。従来の化学固定法ではCyanidiumの細胞は変形してしまい、細胞内構造の保持も不可能であったが、急速凍結置換法を用いることにより、これらの問題点を解決することができた。間期の細胞では、細胞核・ミトコンドリア・色素体が1列に並んでいる(図6A)。まず色素体が分裂を開始してその狭窄部に色素体分裂リングが観察されるころになると、細胞の赤道面の細胞膜直下に収縮リングが現れる(図6B)。収縮リング形成部には、ゴルジ体由来と思われる小胞が多数観察される(図7)。色素体の分裂が完了した後に細胞質分裂が開始され、色素体側からの細胞質の陥入が始まる(図6C,D)。収縮リングは内外2層からなっており、特に内層には、直径約7nmのアクチン繊維の断面と思われる構造物が20数本、筏状に並んでいる(図6E,G)。動物卵の収縮リングに比べると際立った単純さである。細胞核側からの陥入は色素体側からの陥入より遅れて始まり、ミトコンドリアの位置で両極からの陥入がおちあう(図6F)。つまり、ミトコンドリアの位置で細胞質分裂が完了することがわかった。

　電子顕微鏡観察の結果、収縮リング2層のうち内層がアクチン繊維からなる可能性が示唆された。この可能性を検討するためには、抗アクチン抗体を用いた免疫電子顕微鏡法が有効である。しかし、急速凍結置換時に1%グルタルアルデヒド(GA)のアセトン溶液で固定するという一般的な手法をとった場合には、抗体の反応性が乏しかった。そこで、抗DNA抗体を指標に用いて、より反応性の高い固定法を開発した(Takahashi et al.,1997)。固定液としてアセトンのみを用いたところ、1%GAのアセトン溶液を用いた場合に比べて2.6倍の検出感度を得ることができた。そこで、アセトンのみで固定したサンプルに対して抗アクチン抗体処理を行った。その結果、内層に金コロイドが多く検出され、確かに内層はアクチン繊維からなるということがわかった(図8)。収縮に伴う内層の幅と厚さを定量したところ、厚さは不変であるのに対し、幅は収縮とともに増加した(図9)。ファロイジン染色の結果も考慮すると、Cyanidiumでは収縮リングの幅を増加させることでアクチン繊維の量を保ちつつ収縮することになる。また、外層も内層と同じく厚さは不変で、幅が収縮とともに増加していた(図9)。