花粉におけるオルガネラDNA識別法の開発にあたり、精細胞内にミトコンドリアDNAと色素体DNA両方ともが存在する植物、ゼラニウム(Pelargonium zonale)を用いた。従来、花粉オルガネラDNAの観察に用いられていた押しつぶし-DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)染色法(Miyamura et al.1988)では、試料の展開が不十分なために両オルガネラDNAの識別ができなかった。そこで、グルタールアルデヒド固定液の濃度を1%から0.25%へ下げ、押しつぶしの圧力と方向を変えることにより精細胞の内容物をプレパラート上に展開させる新しい条件をみつけ、押しつぶし展開-DAPI染色法と名付けた(Fig.2)。この押しつぶし展開-DAPI染色法では、互いに独立した強い蛍光を放つ輝点として観察されるミトコンドリアDNAと、弱い蛍光のスポットが丸く並ぶ色素体DNAとが容易に識別できるようになった。位相差像ではミトコンドリアは明瞭に観察されないが、色素体は黒く形が確認できることも示された(Fig.3)。

　この手法を用いて、ミトコンドリアDNAと色素体DNAを区別しつつ、花粉形成の後期過程(花粉第二分裂前後)におけるオルガネラDNAの挙動を経時的に追跡した(Fig.4)。オルガネラあたりのDNA量を高感度顕微測光装置(VIMPCS)を用いて定量した結果、ミトコンドリアあたりのDNA量は観察期間を通して大きく変化しなかったのに対し、色素体あたりのDNA量は開花10日前から5日前にかけて少し増加した後急速に減少し、開花日には最大値の約20%、開花6時間後にはわずか4%の値にまで減少することが示された(Fig.4)。さらに、抗DNA抗体を用いた金コロイド免疫電子顕微鏡観察を行ったところ、金コロイド密度の定量結果は蛍光顕微鏡観察による結果と全く一致した(Table 1)。

　以上のようにゼラニウムにおいては、花粉形成後期過程で色素体DNAを減少する機構(母性遺伝の機構)が、不完全ながら作動し得ることが示された。しかしゼラニウムは両性遺伝型植物である。すなわち、両性遺伝型植物ではオルガネラDNAの減少がおこる以前に、消化しつくせない量のDNAが允分に増幅されている可能性があり、花粉形成前期過程(花粉第一分裂前後)を観察する必要性が示唆された。

　押しつぶし展開-DAPI染色法ではできなかった、花粉形成前期過程の観察も可能な、新たなオルガネラDNA識別法の開発を行った。材料としては、花芽誘導が容易であるため均一な花粉が豊富に手に入る、アサガオ(Pharbitis nil)を用いた。

　アサガオの開花時の成熟花粉をまず押しつぶし展開-DAPI染色法を用いて観察すると、雄原細胞内のオルガネラDNAはすべて、色素体と予想される位相差像で黒くみえる顆粒上にあった(Fig.5)。そこで、親水性テクノビット樹脂に包埋した成熟雄原細胞の同一切片を蛍光顕微鏡観察した後に電子顕微鏡観察するというテクノビット電顕法を用いてアサガオの成熟雄原細胞を観察したところ、DAPIの輝点はすべて色素体のものであり、ミトコンドリアにDNAは存在しないことが証明された。さらに、テクノビット樹脂切片に生体膜特異的染色剤であるDiOC₆(3,3’-dihexyloxacarbocyanine iodide)染色を施したところ、ミトコンドリアと色素体の染めわけができることが明らかとなった。ミトコンドリアはDiOC₆により円い均一な顆粒として明瞭に染色されるのに対し、色素体はごく弱く染色され、ときおり内部に完全に黒くぬける澱粉粒が見られる(Fig.7)。この染めわけの確実性は、先のテクノビット電顕法の他、電子顕微鏡観察等の結果と照らし合せて証明された。DiOC₆-DAPIの二重染色法によって、花粉形成の全期間を通じてDNAの輝点がどちらのオルガネラのものかを蛍光顕微鏡だけを用いて簡便に調べることが可能になった。

　DiOC₆-DAPI二重染色法を用いてアサガオ花粉形成過程を追跡したところ、花粉第一分裂直前・直後においてはミトコンドリア、色素体共にDNAを有していたが、分裂後急速に雄原細胞内のミトコンドリアDNAは減少・消失し、反対に色素体DNAは増加するということが示された(Fig.8,Fig.9)。花粉第一分裂後の一時期に雄原細胞のオルガネラDNAが増加するか減少するかが、成熟雄原細胞内のオルガネラの有無を決定している可能性が示された。

　遺伝学的に細胞質遺伝様式が調べられている8種の植物{ゼラニウム(Pelargonium zonale)・バナナ(Musa acuminata)・キーウィ(Actinidia deliciosa)・アルファルファ(Medicago sativa)・ツツジ(Rhododendron maximum)・ベチュニア(Petunia hybrinda)・キンギョソウ(Antirrhinum majus)・シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)}を材料に用いて、成熟雄原細胞を調べた結果、以下の4タイプに分類することできた(Fig.10)。1.ミトコンドリアDNA・色素体DNA共に存在するタイプ(m+p+)(ゼラニウム)、2.ミトコンドリアDNAは存在するが色素体DNAは消失しているタイプ(m+p-)(バナナ)、3.ミトコンドリアDNAは消失しているが色素体DNAは存在するタイプ(m-p+)(キーウィ・アルファルファ・ツツジ)、4.ミトコンドリアDNA・色素体DNA共に消失しているタイプ(m-p-)(ぺチュニア・キンギョソウ・シロイヌナズナ)、である。このうち数種においては、抗DNA抗体を用いた金コロイド免疫電子顕微鏡観察も併用し、オルガネラDNAの存在様式を確認した(Fig.11)。これら細胞学的観察から得られた成熟雄原細胞内のオルガネラDNAの有無と、既知の遺伝学的な証拠による細胞質遺伝様式とを比較した結果、オルガネラDNAが存在する場合は両性遺伝型(父性遺伝との報告を含む)であり、消失している場合は母性遺伝型であることが示された(Table2)。

　テクノビット樹脂切片のDiOC₆-DAPI二重染色法を用いて8種の花粉形成過程を追跡し、VIMPCSを用いてオルガネラあたりのDNA量を定量したところ、花粉第一分裂直後には雄原細胞内のオルガネラにも栄養細胞内のオルガネラとほぼ同じ量のDNAが存在しているが、その後雄原細胞のオルガネラDNAは増加か減少かに振分けられた(Fig.12)。すなわち、成熟期の雄原細胞内にオルガネラDNAが存在する場合(+)は、花粉第一分裂後の雄原細胞でオルガネラDNAが増加し、成熟期に存在しない場合(-)は花粉第一分裂後に減少していた。この花粉第一分裂後のオルガネラDNAの増加・減少の制御がミトコンドリアと色素体とで独立しているために、最終的に4タイプ(m+p+,m+p-,m-p+,m-p-)が生じることになる(Fig.14)。以上のことから、高等植物の細胞質遺伝様式は、花粉第一分裂後の雄原細胞でおこるミトコンドリアと色素体それぞれのDNA量を増加か減少かに導く制御機構により決定されることが明らかになった。